調(diào)控表達(dá)HCV NS5B蛋白小鼠模型的建立.pdf

1、目前全世界有1.7億人感染了丙型肝炎病毒（Hepatitis Cvirus,HCV），HCV感染慢性化往往可以發(fā)展為嚴(yán)重的肝臟疾病，如脂肪肝、肝硬化和肝癌，嚴(yán)重危害人類健康。迄今為止，尚未有疫苗可以預(yù)防HCV感染，而且抗病毒治療成本高、副作用大，療效有限。因此丙型病毒性肝炎是繼乙型病毒性肝炎之后的又一種引起全球廣泛關(guān)注的病毒性肝炎傳染病。
　　長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直致力于對(duì)HCV的防治研究，但是研究進(jìn)展緩慢。這主要是因?yàn)镠CV具有較高

2、的變異性，缺乏穩(wěn)定的HCV感染動(dòng)物模型，嚴(yán)重阻礙了對(duì)HCV致病機(jī)制、抗病毒藥物篩選和疫苗研究的進(jìn)程。目前HCV動(dòng)物模型的研究主要集中在感染動(dòng)物模型、人-鼠肝臟嵌合小鼠模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型三個(gè)方面，但都存在很大的局限性。
　　HCVNS5B是一種RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp），在HCV復(fù)制中起著關(guān)鍵作用。并且鑒于NS5B的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)明確，對(duì)其功能的研究也較為深入，因此NS5B是目前抗HCV的理想靶標(biāo)之一。本研究通過(guò)聯(lián)合使用T

3、et-on四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)和Cre/LoxP基因敲除系統(tǒng)，建立了一個(gè)可在肝臟組織嚴(yán)格調(diào)控表達(dá)HCVNS5B蛋白的三轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下；
　　1.構(gòu)建受Tet-on和Cre/LoxP系統(tǒng)雙重調(diào)控的HCVNS5B真核表達(dá)載體
　　以真核表達(dá)載體pBI-3為載體構(gòu)建骨架，在其啟動(dòng)子的下游依次插入luc報(bào)告基因、BGHPolyA和ns5b基因片段，并分別在luc報(bào)告基因的上游和BGHPolyA尾的下游各引入一個(gè)LoxP

4、位點(diǎn)，成功構(gòu)建了可受Tet-on四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)和Cre/LoxP基因敲除系統(tǒng)雙重調(diào)節(jié)控制的HCVNS5B真核表達(dá)載體，命名為PBI-3/luc-BGHPolyA-NS5B。這種雙調(diào)控設(shè)計(jì)不但可以更為嚴(yán)格的避免漏過(guò)性表達(dá)，而且雙報(bào)告基因的設(shè)計(jì)為后期實(shí)驗(yàn)篩選背景表達(dá)低和誘導(dǎo)性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因小鼠提供了簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。PBI-3/luc-BGHPolyA-NS5B真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建為可嚴(yán)格調(diào)控HCVNS5B蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的建立奠

5、定了良好的基礎(chǔ)。
　　2.建立在Dox誘導(dǎo)下可嚴(yán)格調(diào)控表達(dá)NS5B蛋白的三轉(zhuǎn)基因小鼠
　　將PBI-3/luc-BGHPolyA-NS5B載體線性化后送往上海南方模式生物研究中心制備在Tet-on和Cre/LoxP系統(tǒng)雙重調(diào)控下表達(dá)HCVNS5B蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果獲得了6只NS5B轉(zhuǎn)基因小鼠首建鼠（F0）。將該首建鼠進(jìn)行PCR及Southern bolt鑒定后與C57BL/6小鼠雜交獲得第一代小鼠（F１），PCR法篩選n

6、s5b基因陽(yáng)性小鼠。經(jīng)篩選獲得的ns5b基因陽(yáng)性的小鼠一部分與C57BL/6小鼠繼續(xù)交配，繁殖擴(kuò)群，用PCR法檢測(cè)其是否能夠?qū)⑼庠椿蚍€(wěn)定遺傳；而另一部分與共表達(dá)rtTA和Cre的雙轉(zhuǎn)基因小鼠（rtTALAP-1/LC-1）雜交，篩選共表達(dá)ns5b、Lap、Cre基因的三轉(zhuǎn)基因小鼠。用PCR法分別檢測(cè)ns5b基因、Lap基因和Cre基因片段，三種片段均陽(yáng)性的三轉(zhuǎn)基因小鼠用Dox（鹽酸強(qiáng)力霉素）飲水飼喂一周，小鼠腹腔注射熒光素，用小動(dòng)物在

7、體光學(xué)成像分析系統(tǒng)下檢測(cè)三轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟的發(fā)光信號(hào)，用免疫組化法檢測(cè)Cre重組酶和NS5B蛋白在小鼠肝臟組織中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三轉(zhuǎn)基因小鼠在Dox誘導(dǎo)一周后，只在肝臟部位采集到強(qiáng)烈的特異性熒光信號(hào)，其他部位未采集到信號(hào)，說(shuō)明該三轉(zhuǎn)基因小鼠的調(diào)控性和特異性均良好。免疫組化法證實(shí)Cre重組酶特異性定位于肝細(xì)胞胞核，NS5B蛋白特異性分布于肝細(xì)胞胞漿。
　　綜上所述，通過(guò)聯(lián)合使用Tet-on四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)和Cre/LoxP基因敲除系