不同誘導方法所得Treg樣細胞的多方面比較.pdf

1、目的：
　　 建立MSCV-FOXP3轉導法和TGF-β誘導法獲取調節(jié)性T淋巴細胞(regulatory T cells,Treg)樣細胞的方法體系,比較兩種方法獲得Treg樣細胞的產率及其免疫抑制功能的差異,并初步探討兩種Treg樣細胞發(fā)揮免疫抑制作用相關機制的差異。
　　 方法：
　　 1.構建重組逆轉錄病毒質粒pMSCV-FOXP3,轉染PT67細胞,建立可穩(wěn)定產毒單克隆細胞株；采用差速離心法對病毒進行濃縮

2、。
　　 2.免疫磁珠分選法獲取CD4+CD25-T淋巴細胞；以CD4+CD25-T淋巴細胞為研究對象,采用優(yōu)化后實驗方法進行MSCV-FOXP3轉導和TGF-β誘導獲取Treg樣細胞,以流式細胞術和Real time PCR技術對兩種方法獲得Treg樣細胞的效率進行檢測和比較。
　　 3.應用活性染料CFSE染色和流式細胞術觀察兩種Treg樣細胞和天然Treg細胞對自體CD4+T淋巴細胞增殖活性的影響,用ModFit軟

3、件分析CD4+T淋巴細胞增殖動力學模型。
　　 4.應用ELISA技術,檢測兩種Treg樣細胞培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β的分泌水平；應用Real time PCR技術檢測兩種Treg樣細胞顆粒酶A和顆粒酶B mRNA的轉錄水平差異。
　　 結果：
　　 1.成功構建pMSCV-FOXP3重組質粒,轉染PT67細胞,篩選建立了穩(wěn)定產毒單克隆細胞株,最高病毒滴度為6×105cfu/ml。濃縮后病毒滴度可達1.2×

4、107cfu/ml。
　　 2.免疫磁珠分離獲得CD4+CD25-T淋巴細胞,流式細胞術檢測其純度為92.46％,CD4+CD25+T淋巴細胞純度為90.82％,臺盼藍染色檢測細胞存活率高于90％。當病毒滴度為1×107cfu/ml時,誘導獲得的Treg樣細胞產率最高,可達49.12％；當TGF-β為5ng/ml,誘導時間為第6天時,誘導獲得的Treg樣細胞產率最高,可達41.08％；MSCV-FOXP3轉導組CD4+T淋巴細胞

5、的FOXP3mRNA表達水平高于TGF-β組(P<0.05),MSCV-FOXP3轉導組CD4+T淋巴細胞的FOXP3蛋白陽性率高于TGF-β組(P<0.05)。
　　 3.流式細胞術檢測結果顯示,MSCV-FOXP3轉導CD4+T淋巴細胞獲得的Treg樣細胞、TGF-β誘導獲得的Treg樣細胞以及天然型Treg細胞對自體CD4+T淋巴細胞的增殖均具有明顯抑制作用,與對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 4

6、.MSCV-FOXP3轉導CD4+T淋巴細胞獲得的Treg樣細胞與TGF-β誘導獲得的Treg樣細胞分泌IL-10水平明顯上升,與對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。TGF-β誘導組和MSCV-FOXP3轉導組TGF-β分泌水平較對照組無明顯差異(P>0.05)。顆粒酶B在TGF-β誘導獲得Treg樣細胞表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)。顆粒酶B在TGF-β誘導獲得Treg樣細胞表達水平較顯著高于MSCV-FOXP3轉導