過表達(dá)ZmPP2AA1基因和ZmNF-YA1基因?qū)τ衩字仓昕鼓嫘缘挠绊?pdf

1、植物作為固著生物，其生長(zhǎng)發(fā)育受到干旱、高鹽、冷/熱脅迫和營(yíng)養(yǎng)元素缺乏等非生物逆境脅迫的嚴(yán)峻考驗(yàn)。植物感受逆境脅迫信號(hào)后，通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)不利于自身生長(zhǎng)的環(huán)境因素做出相應(yīng)的應(yīng)答和抵御。其中，激酶/蛋白磷酸酶介導(dǎo)的磷酸化/去磷酸化和轉(zhuǎn)錄因子是響應(yīng)逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究分析了玉米中兩個(gè)應(yīng)答非生物脅迫基因的分子特征以及它們?cè)谟衩椎钟婢抄h(huán)境時(shí)的作用。包括一個(gè)響應(yīng)低磷脅迫的蛋白磷酸酶2A的A亞基基因ZmPP2AA1，和一個(gè)響

2、應(yīng)干旱、高鹽脅迫及離子毒害的轉(zhuǎn)錄因子NF-YA基因ZmNF-YA1。過表達(dá)ZmPP2AA1提高了玉米低磷耐受性
　　玉米是重要的糧飼作物兼工業(yè)原料，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。土壤中的磷儲(chǔ)存很多，但是由于磷對(duì)土壤中的金屬離子親和力高，易形成復(fù)合物，因此植物可吸收利用的無(wú)機(jī)磷嚴(yán)重不足。向農(nóng)田中施入大量的可溶性磷肥可使作物增產(chǎn)，但該措施不僅加大成本而且污染環(huán)境。因此，了解植物適應(yīng)低磷環(huán)境的機(jī)制，利用并改良作物自身固有的高效利用土壤磷素的

3、生物學(xué)特性，開發(fā)高效利用磷營(yíng)養(yǎng)新品種，對(duì)于農(nóng)業(yè)、經(jīng)濟(jì)及環(huán)境具有深遠(yuǎn)意義。
　　根系是吸收磷素的主要器官，已有多項(xiàng)成功案例關(guān)于通過改良植物根系構(gòu)型獲得低磷耐受性的植物。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)低磷培養(yǎng)的玉米根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組及磷酸蛋白組分析中發(fā)現(xiàn)，有2個(gè)PP2A的亞基基因受低磷誘導(dǎo)表達(dá)，一個(gè)催化亞基的蛋白豐度在低磷脅迫時(shí)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，推測(cè)它們的表達(dá)水平變化可能與低磷信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)。本工作中，發(fā)現(xiàn)玉米根中ZmPP2AA1的轉(zhuǎn)錄受低磷脅迫后上調(diào)表達(dá)。為了明確

4、ZmPP2AA1在玉米低磷耐受性中的作用，通過基因工程手段在玉米骨干自交系Qi-319中過表達(dá)ZmPP2AA1和通過RNAi干擾方法降低ZmPP2AA1的表達(dá)水平，比較不同轉(zhuǎn)基因純合系植株在足磷/氐磷條件下的形態(tài)差異和生理生化的變化，進(jìn)而探究ZmPP2AA1在調(diào)節(jié)玉米生長(zhǎng)發(fā)育和低磷耐受性中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制。
　　觀察足磷水培條件下的ZmPP2AA1轉(zhuǎn)基因玉米和野生型對(duì)照自交系Qi-319(WT)的表型，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系的初生

5、根發(fā)生卷曲、軸生根的伸長(zhǎng)受到抑制，而RNAi株系的初生根垂直生長(zhǎng)、軸生根的伸長(zhǎng)受到促進(jìn)。ZmPP2AA1過表達(dá)株系的側(cè)根密度和側(cè)根長(zhǎng)度顯著高于WT的，ZmPP2AA1RNAi株系則表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。這些結(jié)果表明，ZmPP2AA1調(diào)節(jié)玉米初生根的向重性及生長(zhǎng)，且正向調(diào)控側(cè)根的形成和伸長(zhǎng)。
　　根系構(gòu)型的改變是響應(yīng)低磷環(huán)境的典型表型。玉米ZmPP2AA1過表達(dá)、RNAi植株和WT在足磷(SP)或低磷(LP)條件下水培15天后，比較分析

6、各基因型植株的根系形態(tài)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)在低磷條件下過表達(dá)ZmPP2AA1增加了玉米軸生根數(shù)目，刺激了側(cè)根的產(chǎn)生，形成了一個(gè)更為發(fā)達(dá)的根系，顯著增大了活性吸收面積。而ZmPP2AA1RNAi株系中軸生根的數(shù)目與野生型的無(wú)差異、但長(zhǎng)度增加，側(cè)根密度降低，活性吸收面積減小。因此，玉米體內(nèi)ZmPP2AA1基因表達(dá)水平的變化可影響低磷脅迫介導(dǎo)的根系構(gòu)型變化。
　　在遭受低磷脅迫時(shí)，過表達(dá)ZmPP2AA1植株延遲和減少了花青素的積累，積累了較多的干

7、物質(zhì)。而ZmPP2AA1RNAi株系無(wú)論在足磷還是低磷環(huán)境下，其地上、地下部分的干重都顯著低于WT的。低磷環(huán)境下ZmPP2AA1過表達(dá)植株積累了更多的磷素，而RNAi株系的磷積累顯著低于WT的。這與它們的磷吸收能力成正比。無(wú)論在SP或LP條件下，過表達(dá)株系具有更高的Imax值;在低磷脅迫時(shí)，其Km值和Cmin值顯著低于WT的;而ZmPP2AA1RNAi的Km值和Cmin值顯著高于WT的。即在遭遇低磷環(huán)境時(shí)，過表達(dá)ZmPP2AA1玉米植株

8、的根系對(duì)磷的親和力更高，吸收磷的能力更強(qiáng)。過表達(dá)植株體內(nèi)積累較多的磷可緩解低磷脅迫對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用，因此表現(xiàn)出較好的低磷耐受性。在遭受長(zhǎng)期磷缺乏時(shí)，過表達(dá)ZmPP2AA1植株的生殖器官發(fā)育較好，籽粒產(chǎn)量較高。在玉米中過表達(dá)ZmPP2AA1可顯著提高植株對(duì)低磷脅迫的耐受性。
　　ZmPP2AA1可能通過影響根系生長(zhǎng)素的含量和分布調(diào)節(jié)玉米低磷耐受性
　　生長(zhǎng)素是一類參與調(diào)控植物多項(xiàng)生長(zhǎng)發(fā)育的植物激素，且對(duì)低磷誘導(dǎo)的根系構(gòu)型變化

9、起重要調(diào)節(jié)作用。ZmPP2AA1過表達(dá)玉米植株軸生根頂端的生長(zhǎng)素含量顯著高于WT和ZmPP2AA1RNAi的，暗示ZmPP2AA1過表達(dá)植株軸生根卷曲且伸長(zhǎng)受抑制可能與根中生長(zhǎng)素水平及分布的改變相關(guān)聯(lián)。此外，過表達(dá)ZmPP2AA1轉(zhuǎn)基因植株對(duì)生長(zhǎng)素運(yùn)輸抑制劑NPA反應(yīng)更強(qiáng)烈，提示轉(zhuǎn)ZmPP2AA1基因玉米改變了生長(zhǎng)素運(yùn)輸影響玉米根尖生長(zhǎng)素的積累，從而影響根系的生長(zhǎng)發(fā)育及根系構(gòu)型。
　　磷缺乏環(huán)境下過表達(dá)ZmPP2AA1玉米可維持較

10、好的莖葉生長(zhǎng)，形成一個(gè)高度分枝的發(fā)達(dá)根系，增強(qiáng)對(duì)磷的吸收，其耐低磷特性顯著提高。在長(zhǎng)期低磷脅迫時(shí)，過表達(dá)ZmPP2AA1玉米植株因積累更多的磷素，生殖發(fā)育受影響較小，產(chǎn)量顯著高于野生型玉米。
　　ZmNF-YA1參與玉米植株生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性調(diào)控
　　培育對(duì)不利環(huán)境具有較強(qiáng)抗性的作物品種對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有重要意義。NF-Y轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要生物學(xué)功能。課題組在玉米比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)NF-Y轉(zhuǎn)錄因

11、子家族成員ZmNF-YA1基因在抗旱自交系中響應(yīng)干旱脅迫上調(diào)表達(dá)。本工作分析了ZmNF-YA1在玉米不同發(fā)育時(shí)期的不同器官和幾種非生物逆境脅迫下的表達(dá)模式。利用Zm NF-YA1過表達(dá)和Mu轉(zhuǎn)座子插入突變體為材料研究該基因?qū)τ谟衩咨L(zhǎng)發(fā)育和抗逆性的影響。
　　ZmNF-YA1在玉米植株中廣譜表達(dá)，在葉片、授粉后籽粒和花藥中具有較高的表達(dá)水平，暗示ZmNF-YA1可能調(diào)控這些器官的生長(zhǎng)發(fā)育。玉米在遭受滲透脅迫、鹽脅迫和熱脅迫2小時(shí)后

12、，葉片中的ZmNF-YA1的表達(dá)強(qiáng)度升高，且以上三種脅迫連續(xù)處理3天后，還能保持比未處理對(duì)照更高的表達(dá)量，即Zm NF-YA1應(yīng)答和響應(yīng)上述非生物逆境脅迫。
　　觀察溶液培養(yǎng)的ZmNF-YA1過表達(dá)、Mu轉(zhuǎn)座子插入突變體和它們相對(duì)應(yīng)的野生型自交系DH4866、W22的植株表型。在發(fā)育早期，ZmNF-YA1過表達(dá)植株的軸生根較野生型的短，而地上部分與野生型無(wú)明顯差異。由于ZmNF-YA1過表達(dá)株系具有更快的生長(zhǎng)速率，植株高度逐漸高于

13、野生型的，地上部干重也相應(yīng)增加，根系發(fā)達(dá)，側(cè)根數(shù)目多。Mu轉(zhuǎn)座子插入缺失突變體的生長(zhǎng)發(fā)育滯后，其株高、葉片長(zhǎng)寬及面積均顯著低于野生型對(duì)照W22的，根系也不如W22的發(fā)達(dá)。這些結(jié)果表明ZmNF-YA1正向調(diào)節(jié)玉米植株莖葉及根系的生長(zhǎng)發(fā)育。
　　對(duì)三葉期玉米進(jìn)行滲透脅迫、鹽脅迫和離子毒害處理,過表達(dá)ZmNF-YA1轉(zhuǎn)基因株系中干物質(zhì)積累和株高受脅迫抑制的程度較野生型輕，而突變體對(duì)上述三種脅迫的響應(yīng)比其對(duì)照株系更為強(qiáng)烈，受害程度重，表明

14、玉米ZmNF-YA1基因表達(dá)水平的變化可影響植株對(duì)滲透脅迫、鹽脅迫和離子毒害的耐受性，ZmNF-YA1參與玉米植株對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)。
　　過表達(dá)ZmNF-YA1提高了玉米的抗旱性
　　對(duì)五葉期植株進(jìn)行干旱致死處理后再恢復(fù)正常澆水，過表達(dá)ZmNF-YA1植株大部分能恢復(fù)生長(zhǎng)，但其野生型對(duì)照DH4866只有少數(shù)植株能恢復(fù)生長(zhǎng)，Mu轉(zhuǎn)座子插入突變體植株幾乎全部死亡。過表達(dá)ZmNF-YA1可明顯提高苗期玉米植株對(duì)干旱的耐受性。

15、>　　對(duì)開花前的盆栽植株進(jìn)行干旱處理，過表達(dá)ZmNF-YA1植株生長(zhǎng)狀態(tài)好于其野生型對(duì)照，根系更為發(fā)達(dá)，葉片細(xì)胞膜受損傷程度較輕。與此相對(duì)的是過表達(dá)株系葉片積累了更多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，維持較高的相對(duì)含水量，具有顯著升高的抗氧化保護(hù)酶活性，從而提高細(xì)胞對(duì)活性氧等自由基的清除，減少細(xì)胞損傷，維持正常功能。因此，與野生型相比，過表達(dá)ZmNF-YA1有效地提高了玉米的耐旱性。
　　在實(shí)驗(yàn)室王保梅的工作中，過表達(dá)ZmNF-YB16促進(jìn)玉米苗期植

16、株生長(zhǎng)，干旱脅迫誘導(dǎo)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增多、抗氧化酶的活性增強(qiáng)，過表達(dá)ZmNF-YB16植株表現(xiàn)出明顯提高的耐旱性。這些表型與過表達(dá)ZmNF-YA1玉米植株相似。利用酵母雙雜系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)ZmNF-YA1可與ZmNF-YC17結(jié)合，ZmNF-YB16可與ZmNF-YC17結(jié)合。本研究中，利用免疫共沉淀驗(yàn)證了ZmNF-YA1與ZmNF-YC17在玉米體內(nèi)的互作，推測(cè)ZmNF-YA1可能與ZmNF-YB16/-YC17形成復(fù)合體起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，它們共同