NOR-,1-基因?qū)epG2細(xì)胞基因譜表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的： 1、 建立穩(wěn)定的NOR1基因轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系pcDNA3.1(+)/NOR1-HepG2。 2、 應(yīng)用大通量的基因芯片技術(shù)和熒光定量Real-time PCR技術(shù)，分析轉(zhuǎn)染NOR1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞系HepG2基因表達(dá)譜的影響。 3、 探討NOR1基因與差異表達(dá)基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的可能機(jī)制。 方法： 1、 將NOR1基因重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/NOR1(實(shí)驗(yàn)組)和空白載體pcDNA3

2、.1(+)(對(duì)照組)通過脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，用G418篩選陽(yáng)性克隆，建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系pcDNA3.1(+)/NOR1-HepG2(HepG2-NOR1)和pcDNA3.1(+)-HepG2(HepG2-pc)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)對(duì)NOR1基因的表達(dá)進(jìn)行鑒定。 2、 選擇生長(zhǎng)良好的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組培養(yǎng)細(xì)胞，分別提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用人17K基因表達(dá)譜芯片對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)

3、照組細(xì)胞基因組進(jìn)行表達(dá)分析，統(tǒng)計(jì)表達(dá)差異在2倍以上的基因。 3、 用Real-time PCR對(duì)芯片檢測(cè)的部分差異表達(dá)基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。 結(jié)果： 1、 RT-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組NOR1基因表達(dá)明顯高于對(duì)照組，表明pcDNA3.1(+)/NOR1能在HepG2細(xì)胞中表達(dá)。 2、 人17K基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較有162個(gè)基因(或EST)表達(dá)差異在2倍以上，其中59條表達(dá)上調(diào)、103條表達(dá)

4、下調(diào)，涉及細(xì)胞凋亡或腫瘤相關(guān)、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、翻譯調(diào)控等基因。 3、 Real-time PCR對(duì)p15、MAGE-A6檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量分別為對(duì)照組的2.692/2.989和2.535/2.118(Real-timePCR結(jié)果/芯片結(jié)果)，與芯片檢測(cè)結(jié)果相符。cDNA基因芯片和Real-timePCR都是研究差異表達(dá)基因的有力方法，基因芯片篩選基因表達(dá)譜具有高通量大規(guī)模的特點(diǎn)，而熒光定量Real-time PC

5、R則適合單個(gè)基因表達(dá)變化的研究，兩者互為補(bǔ)充和印證。 結(jié)論： 1、 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/NOR1在肝癌細(xì)胞HepG2中穩(wěn)定表達(dá)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/NOR1后肝癌細(xì)胞HepG2的基因表達(dá)譜發(fā)生改變。NOR1基因可能是與肝癌相關(guān)的抑瘤/易感基因侯選者之一?；蛐酒夹g(shù)為大規(guī)模篩選疾病相關(guān)基因及各基因間相互作用提供了可能。 2、 經(jīng)Real-time PCR驗(yàn)證，P15和MAGE-A6基因在實(shí)驗(yàn)組