5-LOX siRNA抑制肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠瘤生長(zhǎng)和可能機(jī)制.pdf

1、目的：通過(guò)siRNA干擾技術(shù)設(shè)計(jì)5-LOX(5-脂氧合酶,5-lipoxygenase)siRNA,檢測(cè)被轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞株HepG2中5-LOX表達(dá)的變化。研究5-LOX siRNA對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用和對(duì)通路蛋白ERK1/2的影響,進(jìn)一步探討體內(nèi)5-LOX基因表達(dá)受抑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用及其作用的機(jī)制,從而進(jìn)一步拓寬肝癌的發(fā)病機(jī)理,為肝腫瘤的基因?qū)W治療提供依據(jù)和靶點(diǎn)。并探討RNAi技術(shù)在肝腫瘤的研究和防治中的價(jià)值。
　　

2、方法：人工合成針對(duì)5-LOX的干擾RNA,并在細(xì)胞水平上將5-LOX siRNA對(duì)人肝癌細(xì)胞株 HepG2進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分成三組:①陽(yáng)性干擾組(轉(zhuǎn)染5-LOX siRNA干擾質(zhì)粒)②陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空白載體質(zhì)粒)③空白組(正常肝癌細(xì)胞不作任何轉(zhuǎn)染)。于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48h,收集細(xì)胞,做實(shí)時(shí)免疫熒光定量PCR檢測(cè)。免疫熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞HepG2中5–LOX基因表達(dá)明顯受抑,驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果確切后,再用上述三組細(xì)胞接種裸鼠皮下建

3、立裸鼠移植瘤模型。實(shí)驗(yàn)裸鼠也隨機(jī)分三組:①轉(zhuǎn)染組(接種陽(yáng)性干擾組HepG2細(xì)胞)、②轉(zhuǎn)染空載體組(接種陰性對(duì)照組HepG2細(xì)胞)、③未轉(zhuǎn)染組(接種空白組HepG2細(xì)胞)。接種21天后處死裸鼠,取出瘤體,測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)的長(zhǎng)徑和與之垂直的短徑,按下式計(jì)算腫瘤體積(腫瘤體積(V)=長(zhǎng)徑×短徑2×0.5)和腫瘤衰退率=轉(zhuǎn)染干預(yù)組平均腫瘤體積比/未轉(zhuǎn)染組平均腫瘤體積(V/Vo)。應(yīng)用蛋白免疫印跡法Western-blot檢測(cè)5-LOX, ERK1/

4、2等通路蛋白水平的變化,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR檢測(cè)5-LOX,ERK1/2的mRNA表達(dá)改變。
　　結(jié)果：①在細(xì)胞轉(zhuǎn)染水平上應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性干擾組siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞后5-LOX的表達(dá)量相對(duì)定量結(jié)果為0.341,明顯較陰性對(duì)照組相對(duì)定量結(jié)果0.822和空白組相對(duì)定量結(jié)果1.074降低(P<0.01)。②在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)組測(cè)量轉(zhuǎn)染組裸鼠腫瘤平均體積為(10.660±4.552)cm3與轉(zhuǎn)染空載體組平均體

5、積(19.576±6.081)cm3及未轉(zhuǎn)染組平均體積(20.465±8.395)cm3比較明顯減小(P<0.01),轉(zhuǎn)染組腫瘤衰退率52.09％。③檢測(cè)轉(zhuǎn)染組腫瘤瘤體5-LOX、ERK1、ERK2蛋白表達(dá)(相對(duì)系數(shù))分別為0.167±0.015、0.187±0.006、0.183±0.015與轉(zhuǎn)染空載體組0.427±0.015、0.367±0.153、0.323±0.021及未轉(zhuǎn)染組0.443±0.021、0.390±0.030、0.

6、343±.015相比明顯下降(P<0.01),而5-LOX、ERK1、ERK2基因mRNA的表達(dá)強(qiáng)度(相對(duì)系數(shù))分別為0.198±0.021、0.193±0.023、0.127±0.026,與轉(zhuǎn)染空載體組0.408±0.047、0.398±0.020、0.297±0.027及未轉(zhuǎn)染組未轉(zhuǎn)染組0.410±0.026、0.400±0.021、0.293±0.029相比下降值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：①siRNA干擾基

7、因表達(dá)是一種切實(shí)可行基因沉默方法之一,經(jīng)過(guò)5-LOX siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2,在細(xì)胞水平上檢測(cè)5-LOX的mRNA表達(dá)明顯受到抑制。②體內(nèi)實(shí)驗(yàn)抑制5-LOX表達(dá)可顯著抑制肝細(xì)胞肝癌瘤體的生長(zhǎng)。③抑制5-LOX表達(dá)測(cè)得腫瘤瘤體組織中5-LOX及信號(hào)通路蛋白ERK1/2表達(dá)下降,結(jié)果提示抑制5-LOX的表達(dá)明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng),其作用機(jī)制可能通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinas