RNA干擾技術(shù)沉默CDC25a基因?qū)θ烁伟〩epG2細(xì)胞增殖和裸鼠移植瘤的影響.pdf

1、目的:觀察基因干擾（RNAi）細(xì)胞分裂周期素25a(Cell division cycle25a，CDC25a)對人肝癌細(xì)胞系HepG2 CDC25a基因的mRNA、蛋白表達(dá)水平的影響，對人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞增殖的影響，對人肝癌系HepG2細(xì)胞裸鼠移植瘤模型瘤體生長的影響。探討CDC25a可能的作用機(jī)制。
　　方法:1.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測三種細(xì)胞:HepG2、SMMC-7721及Sk-hep-1中CDC25a基因中

2、mRNA的表達(dá)水平，篩選實(shí)驗(yàn)所需要的目的細(xì)胞。
　　2.通過RNA干擾技術(shù)構(gòu)建5個(gè)靶向CDC25a基因siRNA慢病毒載體(CDC25a-RNAi載體)，將載體轉(zhuǎn)染至肝癌HepG2細(xì)胞。
　　3.本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為三組:實(shí)驗(yàn)組為CDC25a基因沉默組，用慢病顆粒(LV-CDC25a-RNAi)感染HepG2細(xì)胞;陰性對照組使用對照慢病毒顆粒(LV-RNAi-NC)感染HepG2細(xì)胞;空白對照組不做任何處理，為正常培養(yǎng)的HepG2

3、細(xì)胞。干擾效果以及有效靶點(diǎn)的篩選通過RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測CDC25a基因mRNA及蛋白的表達(dá)進(jìn)行綜合評價(jià)選擇，在5個(gè)靶點(diǎn)中篩選轉(zhuǎn)染效率最高的一個(gè)靶點(diǎn)。
　　4.采用RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR來檢測HepG2細(xì)胞中的CDC25a作用基因CyclinE及CDK2兩個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平。
　　5.采用噻唑藍(lán)(MTT)法、Giemsa染色法檢測細(xì)胞的增殖能力，流式細(xì)胞技術(shù)來檢測

4、細(xì)胞周期。
　　6.將30只雌性裸鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別在雌性裸鼠左側(cè)腋窩下0.5-1cm處的皮下接種3組細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組，陰性對照組，空白對照組），形成瘤體（即成功構(gòu)建裸鼠移植瘤模型）以后連續(xù)4周觀察裸鼠移植瘤體的生長速度并記錄下相應(yīng)時(shí)間段的瘤體大小。4周以后測定腫瘤體積和重量并檢測移植瘤中CDC25a基因的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1.人肝癌系HepG2細(xì)胞中CDC25a基因的mRNA表達(dá)水平高于SMM

5、C-7721、SK-hep-13，且細(xì)胞表達(dá)的基因豐度適合做敲減驗(yàn)證，選取HepG2細(xì)胞選為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。
　　2.將帶有5種靶點(diǎn)CDC25a-RNAi干擾序列的慢病毒載體感染人肝癌系HepG2細(xì)胞，細(xì)胞熒光顯示感染率＞95％。5種靶點(diǎn)CDC25a-RNAi干擾序列在實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞中形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，與陰性對照及空白對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CDC25a的mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05)，陰性對照與空白對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

6、義(P＞0.05);其中以LV-CDC25a-RNAi(9928-1R)(KD1)靶點(diǎn)的沉默效應(yīng)最高，選擇該靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.與陰性對照及空白對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Cyclin E及Cdk2兩種基因的mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)，陰性對照與空白對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.MTT結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在使用CDC25a-RNAi慢病毒形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，與陰性對照及空白對照組相比，細(xì)胞在

7、48、72、96及120h時(shí)間點(diǎn)時(shí)490nm處的吸光光度值均降低(P＜0.05)，在24h時(shí)實(shí)驗(yàn)組的吸光度數(shù)據(jù)值雖然低空白對照組，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.065)。Giemsa染色法結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組的克隆數(shù)為24，明顯低于陰性對照組(克隆數(shù)98)和空白對照組（克隆數(shù)99），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，陰性對照與空白對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。流式細(xì)胞的結(jié)果顯示則實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞被阻滯在G1期，無法進(jìn)入S期。

8、>　　5.實(shí)驗(yàn)組裸鼠、陰性對照組裸鼠及空白對照組裸鼠在接種各組生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞后均能夠形成腫瘤，與陰性對照及空白對照組裸鼠相比，實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤速度減慢、瘤體的體積減小、重量減輕(P＜0.05)，陰性對照與空白對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。此外，與陰性對照及空白對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中CDC25a基因mRNA及蛋白表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.沉默HepG2細(xì)胞的CDC25a基因后能有效的抑制