SEREX方法篩選原發(fā)性肝細胞癌相關抗原.pdf

1、背景和目的；原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)早期不易被發(fā)現(xiàn)，然而從免疫學角度來說腫瘤細胞的改變可以被免疫細胞識別并被免疫系統(tǒng)排斥，從而發(fā)現(xiàn)和診斷HCC。用分子生物學和免疫學的方法鑒定出這些改變的基因和蛋白，可能會為敏感、特異的診斷及免疫治療提供潛在的靶位。HCC發(fā)生發(fā)展的分子基礎之一是多基因表達，但目前總體上HCC的抗原及其編碼基因還遠不清楚，對HCC的抗原研究及以其作為疫苗進行免疫治療尚處于不成

2、熟階段，急需尋找新的抗原分子及鑒定其表位。特異性細胞免疫治療的關鍵在于尋找合適的腫瘤抗原及其抗原表位，而SEREX(serologicalanalysisofrecombinantcDNAexpressionlibrary)方法是鑒定抗原分子的一種方便且高效的方法，迄今為止，用該方法篩選出的HCC相關抗原已有三十多種。因此，我們采用SEREX方法，以HCC患者的血清篩選其cDNA文庫，鑒定出HCC表達的腫瘤抗原，期望為HCC的診斷和預后

3、提供新的標記物，為HCC疫苗的研制及免疫效果監(jiān)測打下基礎，并且為探討HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機理提供依據(jù)。 方法；1.將HCC表達文庫鋪板，轉(zhuǎn)膜，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導蛋白質(zhì)表達，封閉，同預吸收血清反應后，與二抗反應，在二氨聯(lián)苯胺(DAB)的作用下顯色，抗原抗體復合物處呈現(xiàn)紫藍色。重復鋪板和篩選3次，直到獲得單克隆免疫陽性重組噬菌體。2.挑取陽性噬菌斑，噬菌斑塊于SM緩沖液中4℃保存。陽性克隆經(jīng)過體內(nèi)剪切，成

4、為pBluescriptSK-噬菌粒。3.提取質(zhì)粒，經(jīng)XhoⅠ、EcoRⅠ雙酶切初步鑒定插入片段的大小。4.質(zhì)粒以T3、T7通用引物測序，序列結(jié)果用BLAST軟件搜索GenBank，進行比對分析。 結(jié)果；經(jīng)過三輪篩選，從5×105pfu的文庫中篩得81個陽性克隆，其插入片段的大小約在250bp-2300bp之間，平均為1100bp。它們代表57個不同的cDNA序列，其中41個為已知功能的基因，16個為功能未知基因。在已知功能的基