先天性巨細(xì)胞病毒感染致腦發(fā)育異常及其機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景] 人巨細(xì)胞病毒(HCMV)是導(dǎo)致胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損害的首要病因，嚴(yán)重影響兒童生存質(zhì)量，揭示其神經(jīng)損傷機(jī)制，對防治策略的制定和全面提高人口素質(zhì)具有重大社會和經(jīng)濟(jì)意義。但其發(fā)病機(jī)制研究成效甚微，原因在于：①巨細(xì)胞病毒(CMV)具嚴(yán)格種屬特異性，不能建立HCMV感染的動物模型；②CMV是最大的DNA病毒和蛋白嵌合體，其基因動態(tài)表達(dá)，蛋白種類多、功能復(fù)雜；③CMV宮內(nèi)感染致腦發(fā)育異常與發(fā)育階段性密切相關(guān)，如何在動態(tài)

2、發(fā)育的過程中抓住關(guān)鍵時(shí)空進(jìn)行研究也是難點(diǎn)問題。 CMV感染所致CNS損傷主要見于胎兒期，既往認(rèn)為胎兒免疫系統(tǒng)不成熟，不能保護(hù)腦組織免受感染是其主要原因。但近年研究發(fā)現(xiàn)，CMV對發(fā)育中的腦組織有特殊親嗜性，這與細(xì)胞的內(nèi)在原因有關(guān)。因此，CMV感染所致CNS損傷是一種與腦發(fā)育有關(guān)的疾病，必須在CNS動態(tài)發(fā)育過程中研究其發(fā)病機(jī)制。 [目的] 建立適合整體水平研究CMV先天感染的小鼠模型，觀察病毒對不同發(fā)育階段胎腦發(fā)育的

3、影響及其CNS損傷的病理特點(diǎn)。進(jìn)一步利用神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)和胚胎干細(xì)胞(EScells)向神經(jīng)細(xì)胞分化的細(xì)胞模型，在體外模擬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程，在細(xì)胞和分子水平上動態(tài)研究CMV對ES、NSCs及不同發(fā)育階段神經(jīng)細(xì)胞功能和發(fā)育的影響，并探討其中可能涉及的分子機(jī)制，為闡明CMV感染致腦發(fā)育異常機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)，為尋找有效防治措施提供新策略。 [方法] 1MCMV先天感染小鼠模型建立與整體研究 在BALB/c孕

4、鼠孕8d(E8d，孕中期，神經(jīng)管開始形成)和孕13.5d(E13.5d，孕中后期，神經(jīng)元形成高峰期)，采用宮內(nèi)注射法接種含有LacZ報(bào)告基因的MCMV重組毒株RM461(104PFU、103PFU和102PFU)，并以同期注射DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基的孕鼠作為對照。于E18.5d剖宮取出胎鼠，通過X-gal染色和組織切片分析，觀察MCMV接種時(shí)妊娠階段和病毒載量對妊娠結(jié)局、胎鼠CNS發(fā)育和病理損傷特點(diǎn)的影響。 2MCMV對神經(jīng)干細(xì)胞分

5、化發(fā)育細(xì)胞模型的影響 從E13.5d胎鼠腦組織中分離、培養(yǎng)和鑒定NSCs，建立NSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化發(fā)育的細(xì)胞模型；在MCMVRM461感染后，用X-gal染色監(jiān)測感染過程，透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變和病毒顆粒，PCR檢測受染細(xì)胞和培養(yǎng)上清中病毒DNA，并結(jié)合觀察培養(yǎng)上清接種到小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的細(xì)胞病變效應(yīng)共同評估NSCs對MCMV的易感性和感染狀態(tài)；采用細(xì)胞生長曲線和MTT實(shí)驗(yàn)，觀察MCMV對NSCs增殖的影響；采用

6、細(xì)胞免疫化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)分析Nestin、GFAP、NSE和NF-200表達(dá)，探討MCMV對NSCs分化的影響；采用FITC-AnnexinV+PI染色和流式細(xì)胞術(shù)分析病毒對NSCs凋亡的影響；采用Westernblot聯(lián)合RT-PCR法檢測MCMV對NSCs分化相關(guān)基因Wnt-1和Ngn1表達(dá)的影響。 3MCMV對胚胎干細(xì)胞定向分化發(fā)育細(xì)胞模型的影響 以小鼠ES細(xì)胞系D3為研究對象，在4-/4+方案誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向生成

7、神經(jīng)元的基礎(chǔ)上，利用ATRA聯(lián)合星形膠質(zhì)細(xì)胞高效誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向生成神經(jīng)干/前體細(xì)胞和神經(jīng)元；通過形態(tài)學(xué)觀察、畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)、堿性磷酸酶染色、RT-PCR檢測胚胎干細(xì)胞標(biāo)志Oct-4表達(dá)對ES細(xì)胞的全能性進(jìn)行鑒定；用免疫組織化學(xué)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測ES細(xì)胞來源的NSCs的數(shù)量和純度；用分化實(shí)驗(yàn)對所誘導(dǎo)的NSCs的分化潛能進(jìn)行檢測；最后利用ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的細(xì)胞模型探討MCMV對ES細(xì)胞及ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響。 [結(jié)果

8、] 1MCMV先天感染模型建立與整體研究 1)用宮內(nèi)注射法成功建立MCMV先天感染小鼠模型：高病毒載量宮內(nèi)感染極易導(dǎo)致死胎和吸收胎，僅少數(shù)胎鼠存活(5.9％)；低病毒載量感染組存活率明顯提高(47.1％)，但腦組織病毒陽性率隨之下降(12.5％)。103PFU為建立MCMV先天感染模型的合適劑量，其存活率和腦組織病毒陽性率分別為27.8％和80％。2)采用103PFU病毒載量，E8d宮內(nèi)注射MCMV組胎鼠的存活率(26.

9、9％)和體重顯著低于同期DMEM對照組，而吸收胎率(55.8％)高于對照組；E13.5d宮內(nèi)注射MCMV組胎鼠存活率(52.0％)低于同期DMEM對照組，而吸收胎率(14.0％)與對照組無明顯差異。E8d與E13.5d病毒注射組相比，前者存活率低于后者，而吸收胎率高于后者，且發(fā)現(xiàn)小頭畸形鼠3例。 3)MCMV感染胎鼠的腦、心、肝、脾、肺、腎等組織X-gal染色呈陽性反應(yīng)，并且均可分離到病毒，說明該模型是一種全身播散型感染。腦組織

10、X-gal染色顯示陽性細(xì)胞主要位于腦室管膜下區(qū)、海馬區(qū)和大腦皮層的外周部分。 2MCMV對神經(jīng)干細(xì)胞分化發(fā)育的影響 1)體外培養(yǎng)的NSCs可在體外連續(xù)傳代，仍保持球形生長的能力，nestin表達(dá)強(qiáng)陽性，可進(jìn)一步分化NSE、NF-200陽性的神經(jīng)元和GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。 2)MCMV感染NSCs可形成產(chǎn)毒性感染：在感染48h后，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，體積增大，神經(jīng)球邊緣的細(xì)胞發(fā)生脫落和死亡，細(xì)胞形態(tài)改變隨病毒感染復(fù)

11、數(shù)(MOI)的增加而更加明顯；X-gal染色顯示，24h受染細(xì)胞即可出現(xiàn)陽性改變，48h達(dá)高峰；病毒感染72h時(shí)，受染細(xì)胞及培養(yǎng)上清中MCMVDNA呈陽性，培養(yǎng)上清接種到小鼠MEF細(xì)胞后可出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變；電鏡下受染細(xì)胞胞漿中存在病毒顆粒，細(xì)胞器腫脹明顯。 3)MCMV可明顯抑制NSCs的增殖，抑制作用隨MOI增加而增強(qiáng)。 4)MCMV可明顯抑制NSCs的分化：流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，NSCs分化培養(yǎng)2d時(shí)感染組和未感染組n

12、estin陽性細(xì)胞分別為(62.2±1.8)％和(37.2±2.4)％，差異有極顯著性(P＜0.01)；而GFAP陽性細(xì)胞比率分別為(37.4±1.6)％和(50.3±1.8)％，NSE陽性細(xì)胞比率分別為(8.9±0.8)％和(23.4±1.3)％，差異均有極顯著性(P＜0.01)。 5)MCMV對NSCs細(xì)胞凋亡的影響：MCMV感染組與對照組的早期凋亡率和晚期凋亡率均無明顯差異。但感染組細(xì)胞死亡率自感染48h始上升，明顯高于對

13、照組，至第5d可達(dá)(15.2±3.8)％，顯著高于對照組的(5.1±0.3)％。 6)MCMV感染可抑制Wnt-1和Ngn1的表達(dá)：RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，感染組Wnt-1基因表達(dá)量在12h，24h，48h時(shí)低于對照組(P＜0.01)，Ngn1基因表達(dá)量在12h，24h，48h，72h時(shí)均低于對照組(P＜0.01)；Westernblot分析發(fā)現(xiàn)，感染組Wnt-1蛋白表達(dá)量在24h，48h時(shí)低于對照組(P＜0.01)。 3

14、MCMV對胚胎干細(xì)胞定向分化發(fā)育的影響 1)體外培養(yǎng)的小鼠ES細(xì)胞-D3在胚胎成纖維飼養(yǎng)層細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，仍保持向三胚層分化的能力，在免疫缺陷鼠體內(nèi)可形成畸胎瘤；ES細(xì)胞AKP染色和Oct-4表達(dá)陽性。 2)ATRA可促進(jìn)ES細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化：采用4-/4+方案誘導(dǎo)分化的NF-200陽性細(xì)胞為(27.3±1.2)％，而未加ATRA對照組(4-/4-)僅為(2.1±0.4)％(P＜0.01)。 3)2-/2

15、+ATRA聯(lián)合星形膠質(zhì)細(xì)胞(基質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞)可高效誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元，最終可誘導(dǎo)形成純度高達(dá)91.4％的nestin陽性細(xì)胞；nestin陽性細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中可進(jìn)一步分化為神經(jīng)元、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，聯(lián)合誘導(dǎo)組NF-200和NSE陽性率為(42.7±2.6)％，而2-/2+/4-ATRA對照組陽性率僅為(11.2±1.8)％(P＜0.01)。 4)MCMV感染未分化的ES細(xì)胞不能形成產(chǎn)毒性感染，

16、但分化的ES細(xì)胞可形成產(chǎn)毒性感染；MCMV感染不影響未分化ES細(xì)胞的增殖。 5)MCMV感染可抑制ES細(xì)胞來源的神經(jīng)元形成，感染組NF-200陽性細(xì)胞為(10.2±0.3)％，顯著低于對照組的(29.3±0.8)％(P＜0.01)。 [結(jié)論] 1.成功建立了先天性MCMV感染的小鼠模型與NSCs和ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的細(xì)胞模型，為體內(nèi)、外探討CMV先天感染致腦發(fā)育機(jī)制提供了較為切實(shí)可行的、理想的細(xì)胞和整體研究模

17、型。 2.MCMV先天感染可導(dǎo)致明顯的腦發(fā)育異常；MCMV對妊娠結(jié)局的影響與病毒載量、感染的妊娠階段有關(guān)，小鼠妊娠中期對MCMV的敏感性要高于晚期。 3.MCMV可感染體外培養(yǎng)的NSCs，并能形成產(chǎn)毒性感染；MCMV可明顯抑制NSCs的增殖、分化并可導(dǎo)致NSCs死亡；MCMV可通過抑制Wnt-1和Ngn1基因表達(dá)而影響NSCs分化；MCMV抑制NSCs的增殖與分化可能與先天性CMV感染致腦發(fā)育異常有關(guān)。 4.星形