巨細(xì)胞病毒感染在腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常中作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、第一部分人腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常與巨細(xì)胞病毒感染之間相關(guān)性分析
　　目的：探討人腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常與巨細(xì)胞病毒感染之間的相關(guān)性。
　　方法：隨機(jī)選取2012年9月-2014年9月間我科的先天性巨結(jié)腸及同源病的30例患兒血標(biāo)本及60份結(jié)腸標(biāo)本（結(jié)腸標(biāo)本包含近端腸神經(jīng)節(jié)正常段結(jié)腸和遠(yuǎn)端腸神經(jīng)節(jié)異常段結(jié)腸）作為腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常組；選取同時(shí)間段的因腸套疊腸壞死接受腸切除腸吻合的10例患兒血標(biāo)本和10份結(jié)腸標(biāo)本作為對(duì)照組。運(yùn)用ELISA分析兩

2、組患兒血標(biāo)本CMV-IgG和CMV-IgM陽(yáng)性率，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)兩組患兒結(jié)腸標(biāo)本中CMV晚期蛋白表達(dá)，運(yùn)用免疫原位雜交技術(shù)檢測(cè)兩組患兒結(jié)腸標(biāo)本中CMV-DNA，比較兩組患兒結(jié)腸CMV感染的差異，同時(shí)明確CMV感染結(jié)腸的位置。
　　結(jié)果：腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常組30例血標(biāo)本中CMV-IgG抗體陽(yáng)性者8例（26.7％），對(duì)照組血標(biāo)本無(wú)陽(yáng)性病例（P<0.05），CMV-IgM抗體兩組均為陰性；腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常組結(jié)腸標(biāo)本共60份，其中

3、CMV晚期蛋白陽(yáng)性13份（21.7%，其中6份為HD結(jié)腸標(biāo)本，7份為HAD結(jié)腸標(biāo)本，均表達(dá)在腸神經(jīng)節(jié)異常段結(jié)腸），對(duì)照組結(jié)腸標(biāo)本中均未檢測(cè)到CMV晚期蛋白表達(dá)(P<0.05)；在腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常組中原位雜交技術(shù)檢測(cè)到的CMV-DNA陽(yáng)性率與CMV晚期蛋白陽(yáng)性率重疊，對(duì)照組結(jié)腸中未檢測(cè)到CMV-DNA。CMV-DNA與CMV晚期蛋白的陽(yáng)性表達(dá)的位置不同，CMV晚期蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要集中于腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常段結(jié)腸黏膜層、黏膜下層以及小部分的腸肌

4、層的血管內(nèi)皮細(xì)胞，在近端正常的腸神經(jīng)節(jié)內(nèi)無(wú)表達(dá)，CMV-DNA在近端正常結(jié)腸段和遠(yuǎn)端異常段結(jié)腸的黏膜層、黏膜下層、肌層以及神經(jīng)節(jié)均呈棕黃色陽(yáng)性顯色，尤其在腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性顯色。
　　結(jié)論： HCMV感染與腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育異常密切相關(guān)，可能是其發(fā)病的又一重要因素。
　　第二部分先天性 MCMV感染致新生小鼠腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常模型的建立
　　目的：建立先天性MCMV感染致新生鼠腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育異常的模型。
　　

5、方法：將無(wú)MCMV感染6周齡的Balb/c小鼠按雌雄2:1合籠，根據(jù)陰栓判斷孕鼠的受孕時(shí)間，選取小鼠胚胎后腸腸神經(jīng)發(fā)育的起始時(shí)間點(diǎn)對(duì)孕鼠進(jìn)行接種MCMV，在孕鼠受孕11d時(shí)行腹腔接種1ml不同濃度的MCMV病毒懸液，每種濃度5只孕鼠，觀(guān)察不同濃度病毒劑量對(duì)孕鼠及胎鼠的影響，確定造模病毒濃度；確定造模病毒濃度后，選取造模所需的病毒濃度1ml，孕11d時(shí)接種造模濃度MCMV孕鼠作為模型組，含10只孕鼠，同樣孕齡接種不含MCMV的細(xì)胞培養(yǎng)基1

6、ml孕鼠作為對(duì)照組，含5只孕鼠，觀(guān)察兩組小鼠胚胎的存活率，新生小鼠的體重，同時(shí)運(yùn)用PCR檢測(cè)胎鼠結(jié)腸CMV-DNA，免疫組化了解新生鼠結(jié)腸MCMV蛋白的表達(dá)，原位雜交技術(shù)檢測(cè)新生小鼠結(jié)腸CMV特異性核酸序列定位，觀(guān)察胎鼠結(jié)腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞和新生小鼠腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的變化，來(lái)判斷腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育異常模型發(fā)生。
　　結(jié)果：1x102PFU/ul濃度接種孕鼠腹腔后胎鼠腸道中檢測(cè)不到MCMV，對(duì)孕鼠、胎鼠及新生鼠生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)明顯影響；1x104P

7、FU/ul濃度接種孕鼠后，在接種后36h內(nèi)孕鼠全部死亡；1x103PFU/ul濃度的行孕鼠腹腔內(nèi)注射后可導(dǎo)致孕鼠的產(chǎn)量降低，同時(shí)可造成存活新生小鼠腸道巨細(xì)胞病毒感染和腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育異常的發(fā)生，確定造模MCMV濃度為1x103PFU/ul。造模濃度1x103PFU/ul接種的孕鼠為實(shí)驗(yàn)組，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組孕鼠在接種MCMV24小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)反應(yīng)遲緩，食欲下降，活動(dòng)減少，后逐漸恢復(fù)正?；顒?dòng)，同時(shí)觀(guān)察實(shí)驗(yàn)組新生小鼠的體重明顯低于對(duì)照組（P<

8、0.05），實(shí)驗(yàn)組胎鼠及新生鼠腸管CMV晚期蛋白可檢測(cè)到陽(yáng)性表達(dá)，CMV-DNA原位雜交也呈陽(yáng)性，孕鼠腹腔接種可造成胎鼠的先天性CMV感染；實(shí)驗(yàn)組孕鼠中檢測(cè)到新生小鼠發(fā)生腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常的比例約14%，腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常模型新生小鼠與對(duì)照組新生小鼠相比，模型新生鼠腹脹明顯，解剖發(fā)現(xiàn)結(jié)腸遠(yuǎn)端出現(xiàn)狹窄及近端擴(kuò)張，病理特征主要表現(xiàn)為結(jié)腸遠(yuǎn)端腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少（P<0.05）。
　　結(jié)論：先天性 CMV感染可造成腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常模型的發(fā)生

9、，為進(jìn)一步的CMV感染造成腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
　　第三部分先天性MCMV感染后細(xì)胞免疫在腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常中作用機(jī)制的初步探討
　　目的：初步探討先天性MCMV感染后細(xì)胞免疫在小鼠腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常中的作用機(jī)制。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分先天性MCMV感染組和對(duì)照組，對(duì)兩組胎鼠腸管進(jìn)行解剖行離體培養(yǎng)，觀(guān)察比較兩組腸管的蠕動(dòng)及存活時(shí)間情況，運(yùn)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)兩組新生1d小鼠外周血效應(yīng)性DC和CD8+CTL的差

10、異，Western Blot方法檢測(cè)兩組胎鼠結(jié)腸組織特異性殺傷作用的細(xì)胞因子穿孔素和顆粒酶的表達(dá)水平；同時(shí)對(duì)小鼠胚胎GNCSCs進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定，然后與MCMV共培養(yǎng)，運(yùn)用Western Blot共培養(yǎng)后48h后GNCSCs的分子MHC-Ⅰ、Fas、TNFR1表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，先天性MCMV感染的實(shí)驗(yàn)組胎鼠腸體外培養(yǎng)的蠕動(dòng)明顯減弱，平均生長(zhǎng)時(shí)間較正常對(duì)照組縮短（P<0.05）,MCMV感染模型組1d小鼠的

11、外周血CD8+CTL和效應(yīng)DC的比例增高（P<0.05），模型小鼠胚胎結(jié)腸組織穿孔素和顆粒酶的表達(dá)量明顯上升（P<0.05）；GNCSCs與MCMV共培養(yǎng)后48h，與對(duì)照組比較，其形態(tài)及生長(zhǎng)并無(wú)明顯改變，但其表面分子MHC-Ⅰ、Fas和TNFR1表達(dá)量上調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論：先天性CMV感染胚胎后,誘導(dǎo)效應(yīng) DC和CD8+CTL增殖，胚胎腸道的GNCSCs的MHC-Ⅰ、Fas和TNFR1分子表達(dá)上調(diào)，可促使GNCSCs被