巨細胞病毒感染在腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常中作用機制的初步研究.pdf

1、第一部分人腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常與巨細胞病毒感染之間相關(guān)性分析
　　目的：探討人腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常與巨細胞病毒感染之間的相關(guān)性。
　　方法：隨機選取2012年9月-2014年9月間我科的先天性巨結(jié)腸及同源病的30例患兒血標本及60份結(jié)腸標本（結(jié)腸標本包含近端腸神經(jīng)節(jié)正常段結(jié)腸和遠端腸神經(jīng)節(jié)異常段結(jié)腸）作為腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常組；選取同時間段的因腸套疊腸壞死接受腸切除腸吻合的10例患兒血標本和10份結(jié)腸標本作為對照組。運用ELISA分析兩

2、組患兒血標本CMV-IgG和CMV-IgM陽性率，運用免疫組織化學(xué)方法檢測兩組患兒結(jié)腸標本中CMV晚期蛋白表達，運用免疫原位雜交技術(shù)檢測兩組患兒結(jié)腸標本中CMV-DNA，比較兩組患兒結(jié)腸CMV感染的差異，同時明確CMV感染結(jié)腸的位置。
　　結(jié)果：腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常組30例血標本中CMV-IgG抗體陽性者8例（26.7％），對照組血標本無陽性病例（P<0.05），CMV-IgM抗體兩組均為陰性；腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常組結(jié)腸標本共60份，其中

3、CMV晚期蛋白陽性13份（21.7%，其中6份為HD結(jié)腸標本，7份為HAD結(jié)腸標本，均表達在腸神經(jīng)節(jié)異常段結(jié)腸），對照組結(jié)腸標本中均未檢測到CMV晚期蛋白表達(P<0.05)；在腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常組中原位雜交技術(shù)檢測到的CMV-DNA陽性率與CMV晚期蛋白陽性率重疊，對照組結(jié)腸中未檢測到CMV-DNA。CMV-DNA與CMV晚期蛋白的陽性表達的位置不同，CMV晚期蛋白陽性表達主要集中于腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常段結(jié)腸黏膜層、黏膜下層以及小部分的腸肌

4、層的血管內(nèi)皮細胞，在近端正常的腸神經(jīng)節(jié)內(nèi)無表達，CMV-DNA在近端正常結(jié)腸段和遠端異常段結(jié)腸的黏膜層、黏膜下層、肌層以及神經(jīng)節(jié)均呈棕黃色陽性顯色，尤其在腸神經(jīng)節(jié)細胞中呈強陽性顯色。
　　結(jié)論： HCMV感染與腸道神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育異常密切相關(guān)，可能是其發(fā)病的又一重要因素。
　　第二部分先天性 MCMV感染致新生小鼠腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常模型的建立
　　目的：建立先天性MCMV感染致新生鼠腸神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育異常的模型。
　　

5、方法：將無MCMV感染6周齡的Balb/c小鼠按雌雄2:1合籠，根據(jù)陰栓判斷孕鼠的受孕時間，選取小鼠胚胎后腸腸神經(jīng)發(fā)育的起始時間點對孕鼠進行接種MCMV，在孕鼠受孕11d時行腹腔接種1ml不同濃度的MCMV病毒懸液，每種濃度5只孕鼠，觀察不同濃度病毒劑量對孕鼠及胎鼠的影響，確定造模病毒濃度；確定造模病毒濃度后，選取造模所需的病毒濃度1ml，孕11d時接種造模濃度MCMV孕鼠作為模型組，含10只孕鼠，同樣孕齡接種不含MCMV的細胞培養(yǎng)基1

6、ml孕鼠作為對照組，含5只孕鼠，觀察兩組小鼠胚胎的存活率，新生小鼠的體重，同時運用PCR檢測胎鼠結(jié)腸CMV-DNA，免疫組化了解新生鼠結(jié)腸MCMV蛋白的表達，原位雜交技術(shù)檢測新生小鼠結(jié)腸CMV特異性核酸序列定位，觀察胎鼠結(jié)腸神經(jīng)嵴干細胞和新生小鼠腸神經(jīng)節(jié)細胞的變化，來判斷腸神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育異常模型發(fā)生。
　　結(jié)果：1x102PFU/ul濃度接種孕鼠腹腔后胎鼠腸道中檢測不到MCMV，對孕鼠、胎鼠及新生鼠生長發(fā)育無明顯影響；1x104P

7、FU/ul濃度接種孕鼠后，在接種后36h內(nèi)孕鼠全部死亡；1x103PFU/ul濃度的行孕鼠腹腔內(nèi)注射后可導(dǎo)致孕鼠的產(chǎn)量降低，同時可造成存活新生小鼠腸道巨細胞病毒感染和腸神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育異常的發(fā)生，確定造模MCMV濃度為1x103PFU/ul。造模濃度1x103PFU/ul接種的孕鼠為實驗組，與對照組相比，實驗組孕鼠在接種MCMV24小時內(nèi)出現(xiàn)反應(yīng)遲緩，食欲下降，活動減少，后逐漸恢復(fù)正?；顒?，同時觀察實驗組新生小鼠的體重明顯低于對照組（P<

8、0.05），實驗組胎鼠及新生鼠腸管CMV晚期蛋白可檢測到陽性表達，CMV-DNA原位雜交也呈陽性，孕鼠腹腔接種可造成胎鼠的先天性CMV感染；實驗組孕鼠中檢測到新生小鼠發(fā)生腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常的比例約14%，腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常模型新生小鼠與對照組新生小鼠相比，模型新生鼠腹脹明顯，解剖發(fā)現(xiàn)結(jié)腸遠端出現(xiàn)狹窄及近端擴張，病理特征主要表現(xiàn)為結(jié)腸遠端腸神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量減少（P<0.05）。
　　結(jié)論：先天性 CMV感染可造成腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常模型的發(fā)生

9、，為進一步的CMV感染造成腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的機制研究奠定基礎(chǔ)。
　　第三部分先天性MCMV感染后細胞免疫在腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常中作用機制的初步探討
　　目的：初步探討先天性MCMV感染后細胞免疫在小鼠腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常中的作用機制。
　　方法：實驗分先天性MCMV感染組和對照組，對兩組胎鼠腸管進行解剖行離體培養(yǎng)，觀察比較兩組腸管的蠕動及存活時間情況，運用流式細胞學(xué)技術(shù)檢測兩組新生1d小鼠外周血效應(yīng)性DC和CD8+CTL的差

10、異，Western Blot方法檢測兩組胎鼠結(jié)腸組織特異性殺傷作用的細胞因子穿孔素和顆粒酶的表達水平；同時對小鼠胚胎GNCSCs進行分離、培養(yǎng)和鑒定，然后與MCMV共培養(yǎng)，運用Western Blot共培養(yǎng)后48h后GNCSCs的分子MHC-Ⅰ、Fas、TNFR1表達水平變化。
　　結(jié)果：與對照組相比，先天性MCMV感染的實驗組胎鼠腸體外培養(yǎng)的蠕動明顯減弱，平均生長時間較正常對照組縮短（P<0.05）,MCMV感染模型組1d小鼠的

11、外周血CD8+CTL和效應(yīng)DC的比例增高（P<0.05），模型小鼠胚胎結(jié)腸組織穿孔素和顆粒酶的表達量明顯上升（P<0.05）；GNCSCs與MCMV共培養(yǎng)后48h，與對照組比較，其形態(tài)及生長并無明顯改變，但其表面分子MHC-Ⅰ、Fas和TNFR1表達量上調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論：先天性CMV感染胚胎后,誘導(dǎo)效應(yīng) DC和CD8+CTL增殖，胚胎腸道的GNCSCs的MHC-Ⅰ、Fas和TNFR1分子表達上調(diào)，可促使GNCSCs被