苦瓜過(guò)氧化物酶對(duì)茋類(lèi)及黃酮類(lèi)天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、植物過(guò)氧化物酶是一類(lèi)以血紅素為輔基的酶類(lèi)，在植物界中廣泛存在，主要催化H<,2>O<,2>和過(guò)氧化物對(duì)有機(jī)物氧化，有著廣泛的生理作用。本論文從苦瓜果實(shí)中提取分離過(guò)氧化物酶(MCP)并實(shí)現(xiàn)其對(duì)芪類(lèi)及黃酮類(lèi)天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化，分離并鑒定了16個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中新化合物5個(gè)，首次利用過(guò)氧化物酶實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化而獲得的已知化合物2個(gè)．首次利用苦瓜討氧化物酶實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化而獲得的已知化合物8個(gè)。對(duì)其中3個(gè)生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行了自由基清除活

2、性實(shí)驗(yàn). 1.苦瓜過(guò)氧化物酶的提取分離 苦瓜果實(shí)經(jīng)tris-HCl緩沖液抽提、(NH4)<,2>S0<,4>鹽析得到過(guò)氧化物酶粗蛋白，經(jīng)非變性不連續(xù)聚丙烯酞胺垂直平板電泳，發(fā)現(xiàn)其中主要含有三條過(guò)氧化物酶同工酶譜帶，利用Bradford檢測(cè)法測(cè)定其蛋白含量為0.86 mg/ml，并用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定其酶活為3786.05 U/mgo 2.苦瓜過(guò)氧化物酶對(duì)芪類(lèi)及黃酮類(lèi)天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化研究 芪類(lèi)化合物是一類(lèi)

3、在各種誘發(fā)因子或植物病原菌的侵染作用下誘導(dǎo)合成的多酚類(lèi)次生代謝物。其中，白黎蘆醇是廣泛存在于水果、中藥和葡萄酒中的一種菌類(lèi)植物抗毒素，其低聚物具有廣泛的生物學(xué)活性，如抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗凝血、抗HIV、抗炎抗菌、免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)保護(hù)等。 為進(jìn)一步利用芪類(lèi)天然產(chǎn)物資源，探討了苦瓜過(guò)氧化物酶對(duì)白黎蘆醇的生物轉(zhuǎn)化。利用苦瓜過(guò)氧化物酶，在醋酸緩沖液(pH 5.0)/丙酮反應(yīng)體系中25℃條件下催化氧化白黎蘆醇，獲得其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，經(jīng)硅膠

4、柱層析，Sephadex LH-20柱，半制備高效液相等色譜技術(shù)分離得到6個(gè)化合物，分別為resveratrol trans-dehydrodimer (Ⅰ),parthenostilbenins A and B (Ⅱ, Ⅲ)，restrytisol B (IV)，leachianol G (Ⅴ)，7-o-acetylatedleachianol G(VI)。其中，化合物VI為新化合物，化合物Ⅱ，Ⅲ為首次利用過(guò)氧化物酶實(shí)現(xiàn)白藜蘆醇的生物

5、轉(zhuǎn)化而得到的已知化合物，化合物Ⅰ，Ⅳ，Ⅴ為首次利用MCP實(shí)現(xiàn)白藜蘆醇的生物轉(zhuǎn)化而得到的已知化合物。此外，本文運(yùn)用HPLC法深入探討了苦瓜粗蛋白在不同生物轉(zhuǎn)化條件下催化白藜蘆醇轉(zhuǎn)化反應(yīng)的規(guī)律。發(fā)現(xiàn)25℃下，在醋酸緩沖液(pH 5.0)/丙酮反應(yīng)體系中，H<,2>O<,2>濃度為0.11 mol/L，時(shí)，白藜蘆醇的轉(zhuǎn)化率最高，反應(yīng)在滴加H<,2>O<,2>后10 min內(nèi)完成，反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)并不有利于反應(yīng)進(jìn)行。利用苦瓜粗蛋白在醋酸緩沖液(p

6、H 5.0)/丙酮反應(yīng)體系中30℃條件下催化氧化白藜蘆醇及阿魏酸的1/1混合物(摩爾比)，獲得其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，運(yùn)用LC-MS法對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分析，除發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇與阿魏酸各自的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物外，還得到了白藜蘆醇與阿魏酸的二聚體，經(jīng)硅膠柱層析，半制備高效液相等色譜分離技術(shù)及重結(jié)晶技術(shù)純化得到2個(gè)化合物，一個(gè)是阿魏酸的脫氫二聚體(Ⅶ)，另一個(gè)是白藜蘆醇和阿魏酸的二聚體(Ⅷ)，化合物Ⅷ為新化合物。 天然黃酮類(lèi)化合物是植物體多酚類(lèi)的中間體或代謝

7、物，廣泛存在于藥用植物、水果和蔬菜中?，F(xiàn)代藥理研究表明，該類(lèi)化合物在心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和抗腫瘤方面有明顯的藥理作用，其抗氧化性質(zhì)及其在植物氧化酶作用下的代謝，亦引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注。 本文利用苦瓜粗蛋白在醋酸緩沖液中(pH 5.0)/乙醇反應(yīng)體系25℃條件下催化氧化槲皮素，獲得其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，經(jīng)硅膠柱層析，Sephadex LH-20柱，半制備高效液相等色譜技術(shù)分離得到6個(gè)化合物，IX，X，Xl，XII，XllI，XIV，其

8、中XII，XIII為新化合物，IX，x，XI，XIV是首次利用MCP實(shí)現(xiàn)槲皮素的生物轉(zhuǎn)化而得到的已知化合物。 利用苦瓜粗蛋白在醋酸緩沖液中(pH 5.0)/二氧六環(huán)反應(yīng)體系25℃條件下催化氧化葛根素，獲得其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，經(jīng)硅膠柱層析，Sephadex LH．20柱，半制備高效液相等色譜技術(shù)分離得到2個(gè)化合物，其中一個(gè)為葛根素的乙酰化產(chǎn)物XV，一個(gè)為脫水產(chǎn)物XVI，化合物XVI為新化合物，XV是首次利用MCP實(shí)現(xiàn)葛根素的生物轉(zhuǎn)化而