魚類腸型點狀氣單胞菌口服疫苗微粒的制備及免疫保護效應研究.pdf

1、本論文包括三個實驗，分別研究了腸型點狀氣單胞菌的分離和鑒定、半致死濃度的確定、腸型點狀氣單胞菌微粒的制備和腸型點狀氣單胞菌微粒對草魚的免疫保護效應。在實驗過程中，首先進行了發(fā)病草魚病原菌的分離、純化、鑒定，確定了病原菌的半致死濃度，為下一步的免疫保護效應做準備；在微粒制備實驗中，通過復乳溶劑揮發(fā)法制備疫苗微粒，采用對比實驗確定適合草魚攝食的微粒直徑的實驗條件；研究的關鍵是確定制備的疫苗微粒能否起到保護的作用，主要通過兩種方法來判定：第一

2、，免疫進行過程中，不同時間段提取免疫草魚的血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定抗體的滴度大小，初步確定是否能夠引起草魚的免疫應答。第二，通過草魚的保護實驗確定保護率，為今后口服疫苗的大規(guī)模應用提供依據(jù)。 1、腸型點狀氣單胞菌的分離、鑒定、半致死濃度的確定首先，分離、純化瀕臨死亡的患病草魚的致病菌，然后通過生化細菌鑒定管鑒別該細菌的種類，結果表明該細菌為腸型點狀氣單胞菌，設計不同的細菌濃度梯度注射草魚，獲得腸型點狀氣單胞菌對草魚的LC<,

3、50>為10<'6.2>CFU/ml。 2、腸型點狀氣單胞菌口服疫苗微粒的制備實驗采用復乳溶劑揮發(fā)法制備口服疫苗微粒，通過考馬斯亮藍法測定微粒的的蛋白質含量，進而確定微粒的載藥量和包封率?？疾炀垡蚁┐既芤簼舛取⒕郾┧針渲瑵舛?、二氯甲烷/聚乙烯醇溶液體積比以及不同勻漿轉速對微粒粒徑、載藥量、包封率的影響。通過實驗結果得出腸型點狀氣單胞菌口服疫苗制備條件為：聚乙烯醇溶液濃度為6％，聚炳烯酸樹脂的濃度為60 mg/ml，超聲功率為4

4、00 w，勻漿轉速為9500 r/min，可以保證微粒的直徑為10μm左右。同時菌體疫苗微粒的蛋白質含量分別為6.32％：蛋白質包裹效率為62.35％。體外釋放實驗表明微粒具有緩釋作用，達到實驗要求的標準。 3、腸型點狀氣單胞菌微粒對草魚的免疫保護效應采用注射全菌疫苗組、佐劑疫苗組和通過制成飼料口服投喂疫苗微粒方法分三次免疫健康草魚，在第一次免疫后的不同時間段測定草魚的抗體滴度，結果顯示：全菌疫苗微粒組、佐劑疫苗組和口服疫苗組均

5、可檢測到明顯的血清抗體，但三種疫苗的免疫原性的強弱有所不同，佐劑疫苗組的抗體水平明顯高于其它2組(P<0.05)，其次為全菌疫苗組。同時結果表明口服疫苗組的抗體滴度隨著時間的推移下降幅度低于其他兩組，說明口服疫苗具有緩釋的作用。保護實驗顯示：全菌疫苗微粒組、佐劑疫苗組、口服疫苗組和對照組的存活率分別為55％、75％、37.5％及7.5％，根據(jù)各組草魚的存活率、平均存活時間進行分析，發(fā)現(xiàn)全菌疫苗、佐劑疫苗和口服疫苗均對草魚具有保護效應，與