沙門菌OmpD介導(dǎo)的rBCG口服疫苗的制備與鑒定.pdf

1、重組活菌疫苗是以某些減毒或者無毒力的活菌為載體,將病原體的保護(hù)性抗原基因插入細(xì)菌的基因組或者質(zhì)粒DNA中并使之高效表達(dá)的一種新型疫苗。重組卡介苗(Recombinant Bacillus Calmette-Guerin,rBCG)就是重組活菌疫苗中具有代表性的新型疫苗。它是以BCG為工程菌,借助分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行基因改造,利用其活疫苗特性,在機(jī)體內(nèi)表達(dá)各種疾病的相關(guān)抗原,從而達(dá)到預(yù)防和治療多種疾病的目的。
　　本研究小組曾成功

2、將屋塵螨抗原Der p2基因轉(zhuǎn)入BCG中表達(dá),制備出抗原Der p2-rBCG。經(jīng)靜脈和腹腔注射接種后,在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了Der p2特異性的Th1優(yōu)勢應(yīng)答。因此我們推測可以通過抗原rBCG疫苗來治療對某些特定抗原過敏的疾病。目前分枝桿菌幾乎全部是以皮下注射的方式接種。但是研究發(fā)現(xiàn),如果短期內(nèi)重復(fù)皮下注射接種rBCG會引起局部嚴(yán)重的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)(DTH),因此我們考慮采用口服途徑接種rBCG。而且,我們前期的研究發(fā)現(xiàn)給小鼠口服Der p

3、2-rBCG,同樣可以誘導(dǎo)抗原特異性的Th1應(yīng)答。然而,BCG分枝桿菌并不是腸道定植菌,與腸黏膜的親和力低,大量口服還會引起腸道正常菌群失調(diào)及口咽部感染,從而影響免疫效果。文獻(xiàn)回顧發(fā)現(xiàn),沙門菌外膜蛋白Omp D介導(dǎo)了沙門菌與腸黏膜上皮的黏附,因此我們設(shè)想此外膜蛋白能夠介導(dǎo)rBCG與腸道黏膜的高親和力結(jié)合,從而制備出具有腸道高親和力的rBCG口服疫苗。目的利用分子生物學(xué)及基因工程技術(shù),構(gòu)建能以串聯(lián)和并聯(lián)形式、在細(xì)菌表面表達(dá)Der p2和O

4、mp D抗原的兩種rBCG口服疫苗,為體外實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果:1. Omp D蛋白的表達(dá)及純化以鼠傷寒沙門菌Salmonella typhimurium基因組為模板,通過PCR來擴(kuò)增Omp D基因,與pMD-18T克隆載體連接后測序,結(jié)果與Genbank公布的Omp D基因序列完全一致。將Omp D基因克隆入原核表達(dá)載體pET-28a(+),經(jīng)PCR和酶切鑒定后,陽性質(zhì)粒命名為pET28a(+)-Omp

5、D,并經(jīng)IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析證實(shí)成功表達(dá)了與預(yù)期分子量一致的Omp D蛋白。Western-blot證實(shí)該蛋白可與抗6×His-mAb發(fā)生特異性反應(yīng)?？扇苄苑治鲲@示該蛋白以包涵體形式存在于沉淀中,經(jīng)Ni+-NTA親和色譜法純化獲得了目的蛋白,且純度達(dá)90％以上。
　　2.兔Omp D多克隆抗體的制備及鑒定重組蛋白經(jīng)變性、復(fù)性后,按100μg/kg的純化蛋白加等量弗氏完全佐劑(FCA)乳化后接種于兔頸背部皮內(nèi),

6、間隔2w后再進(jìn)行第二、三次免疫;第三次免疫結(jié)束2w后以等量重組蛋白追加免疫1次,1w后收集血液,分離血清后ELISA檢測特異性抗體效價(jià)達(dá)到1:10000以上。Western-blot檢測表明,該抗體能與Omp D蛋白發(fā)生特異性結(jié)合,其特異性與敏感性均較好。
　　3.兩種rBCG口服疫苗的構(gòu)建與鑒定為了獲得Der p2-Omp D融合基因,我們重新設(shè)計(jì)引物,經(jīng)PCR法分別擴(kuò)增獲得新的Der p2和Omp D基因,測序正確后將兩者克隆

7、入原核表達(dá)載體pProEX HTb,獲得pProEX HTb-Der p2-Omp D質(zhì)粒。
　?、俅?lián)表達(dá):將Der p2-Omp D融合基因亞克隆入穿梭胞壁表達(dá)載體pCW,經(jīng)酶切鑒定陽性命名為pCW-Der p2-Omp D質(zhì)粒。將此重組質(zhì)粒電穿導(dǎo)入BCG感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建可胞壁串聯(lián)表達(dá)Der p2-Omp D融合蛋白的rBCG;
　?、诓⒙?lián)表達(dá):構(gòu)建pCW-Der p2與pCW-Omp D兩種質(zhì)粒,并將二者同時(shí)電穿導(dǎo)入B

8、CG感受態(tài)細(xì)胞,以構(gòu)建胞壁并聯(lián)表達(dá)Der p2和Omp D蛋白的rBCG。經(jīng)潮霉素抗性篩選的陽性克隆,均采用以下三種方式進(jìn)行鑒定:PCR特異性擴(kuò)增目的基因片段;用兔抗Der p2多克隆抗體與兔抗Omp D多克隆抗體對陽性克隆分別進(jìn)行斑點(diǎn)免疫雜交法和間接免疫熒光法鑒定。證實(shí)兩種rBCG口服疫苗構(gòu)建成功,并能與特異性抗體發(fā)生反應(yīng)。
　　結(jié)論:1.在E.coli表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)并純化出Omp D蛋白。該蛋白能夠與6×His-mAb發(fā)生