豬巨噬細(xì)胞cDNA文庫及胸膜肺炎放線桿菌apxⅢ誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建和豬呼吸道病原菌的多重PCR檢測方法的建立.pdf

1、本論文包括3部分： 1．豬肺巨噬細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫的構(gòu)建 巨噬細(xì)胞具有吞噬外來顆粒、產(chǎn)生細(xì)胞因子和抗原提呈等多種功能。在抗病原微生物感染過程中，巨噬細(xì)胞與病原微生物的相互作用如何，人們?nèi)运跎佟Ｒ虼?，為進(jìn)一步研究微生物與巨噬細(xì)胞之間的相互作用奠定基礎(chǔ)，構(gòu)建了一個(gè)巨噬細(xì)胞的酵母雙雜交cDNA文庫，即建立一種研究資源平臺(tái)。然后運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)，篩選文庫中與病原微生物致病因子相互作用的蛋白，從而進(jìn)一步探討病原微生物在感

2、染過程中與巨噬細(xì)胞相互作用的機(jī)理。 本實(shí)驗(yàn)中，分離純化了健康小豬肺巨噬細(xì)胞的原代細(xì)胞。提取細(xì)胞的RNA，用SMART技術(shù)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。去除cDNA短片段，消除cDNA豐度差異，將cDNA轉(zhuǎn)化酵母，建立了豬肺巨噬細(xì)胞的酵母雙雜交標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫。并對文庫的質(zhì)量進(jìn)行了鑒定。其結(jié)果顯示，構(gòu)建的文庫中插入片段大小平均約1.3KB，片段多態(tài)性分布良好，文庫的轉(zhuǎn)化克隆子數(shù)目大于1×10<'6>，調(diào)整后的滴度達(dá)到1×10<'8>，有良好

3、的質(zhì)量滿足酵母雙雜交篩選目的蛋白的需要。 2．胸膜肺炎放線桿菌apxⅢ誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建 外毒素是胸膜肺炎放線桿菌的主要致病因子之一。它與胸膜肺炎放線桿菌的致病力有重要關(guān)系。ApxⅢ具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，本實(shí)驗(yàn)克隆了胸膜肺炎放線桿菌毒素ApxⅢ中420aa-680aa的基因序列到pGBK-T7載體中，構(gòu)建了胸膜肺炎放線桿菌毒素apxⅢA誘餌質(zhì)粒，并在酵母中表達(dá)了該誘餌蛋白。該誘餌蛋白可用于酵母雙雜交進(jìn)行篩選，為找到該毒素與

4、豬肺巨噬細(xì)胞相互作用的蛋白打下了基礎(chǔ)。 3．豬常見的5種呼吸道疾病多重PCR診斷方法的建立 近年來，養(yǎng)豬業(yè)中呼吸道疾病日益突出，呼吸道疾病的發(fā)生呈現(xiàn)多重感染或混合感染從而使病情復(fù)雜化的新特點(diǎn)。引起豬呼吸道疾病的細(xì)菌性病原微生物主要有五種：胸膜肺炎放線桿菌（APP）、副豬嗜血桿菌（HPS）、豬肺炎支原體（Mph）、支氣管敗血波氏桿菌（Bb）和多殺性巴氏桿菌（Pm），它們分別導(dǎo)致豬傳染性胸膜肺炎，豬革斯氏病，豬氣喘病和豬傳染

5、性萎縮性鼻炎等疾病，這些呼吸道疾病的流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。準(zhǔn)確診斷單一病原或多重病原感染大大有利于疾病的控制。然而，我國目前尚無用于檢測上述疾病的混合感染的方法。 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Genebank上公布的豬胸膜肺炎放線桿菌特異性apxⅣ基因、豬產(chǎn)毒多殺巴氏桿菌toxA基因、豬波氏桿菌fla基因、副豬嗜血桿菌16S rRNA基因和豬肺炎支原體P36基因，設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行多重PCR檢測。經(jīng)過條件優(yōu)化，該方法能擴(kuò)增出預(yù)期

6、的377bp（APP），422bp（Pm），235（Bb），287（Mph），821bp（HPS）片段。其敏感度分別為1.0×10<'3>（APP），1.0×10<'3>（Pm），1.0×10<'3>（Bb），5.0×10<'2>（Mph），5.0×10<'2>（HPS）CFU。而用其它細(xì)菌均未擴(kuò)出條帶，顯示了很好的特異性。分別用APP、Bb、HPS和Pm進(jìn)行動(dòng)物小鼠感染試驗(yàn)。結(jié)果表明可以從所有感染的動(dòng)物病料組織中檢測出相應(yīng)的病原菌。和