核因子кB通路參與缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α.pdf

1、目的：
　　 探討缺氧刺激能否誘導(dǎo)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α），核因子кB（nuclear factor кB，NF-кB）通路是否參與其中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：
　　 1％O2物理缺氧刺激原代培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，在不同時間點采用Real-time PCR(Polymerase Chain Reaction，PCR)檢測TNF-αmR

2、NA水平；酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測培養(yǎng)上清中TNF-α蛋白水平；western blot檢測心肌細(xì)胞胞漿NF-кB相關(guān)通路蛋白IKKα，IKKβ，IкBα蛋白及磷酸化蛋白水平以及心肌細(xì)胞核NF-кB p65蛋白表達(dá)；電泳遷移率實驗（e1ectrophoretic mobility shift assay，EMSA）檢測細(xì)胞核蛋白NF-кB DNA結(jié)合能力。缺氧

3、同時給予NF-кB抑制劑四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）刺激心肌細(xì)胞，檢測心肌細(xì)胞核p65蛋白表達(dá)，TNF-αmRNA及蛋白水平。
　　 結(jié)果：
　　 缺氧誘導(dǎo)原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞表達(dá)TNF-α，TNF-αmRNA水平從缺氧1h開始升高，12h及24h達(dá)峰值；其蛋白分泌從缺氧6h開始升高，缺氧12h和24h達(dá)峰值。缺氧激活NF-кB通路：缺氧5min胞漿pIKKα

4、/IKKβ表達(dá)開始上調(diào)，30min達(dá)峰值，持續(xù)6h；IкBα表達(dá)缺氧5min開始降低，而pIкBα水平缺氧30min開始增加；胞核p65水平缺氧5min明顯上調(diào)，1h達(dá)峰值，持續(xù)6h；NF-кB DNA結(jié)合能力缺氧5min開始增強(qiáng)。PDTC抑制NF-кB活性，有效抑制TNFαmRNA水平及其蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 缺氧通過激活NF-кB通路，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自分泌TNF-α，NF-кB在缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自分泌TNF-