CD59配體肽基因真核表達體系的構(gòu)建及對前列腺癌PC-3細胞活性的作用研究.pdf

1、CD59配體肽基因真核表達體系的構(gòu)建及對前列腺癌PC3細胞活性的作用研究摘要目的構(gòu)建CD59分子配體肽(sp22)基因真核表達重組體系，探討sp22基因?qū)毎鸆D59分子表達及功能的影響，為進～步研究sp22分子與CD59分子的作用機制及利用短肽封閉CD59分子表達，為腫瘤基因靶向治療開辟新途徑。方法構(gòu)建含特異性sp22基因的真核重組表達載體sp—pIRES，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人前列腺癌PC一3細胞，G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，RT—PC

2、R檢測轉(zhuǎn)染細胞中sp22基因mRNA的表達并篩選陽性細胞克隆，RT—PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞表面CD59mRNA表達量的變化，WesternBlot、ELISA競爭抑制試驗檢測轉(zhuǎn)染細胞CD59蛋白的表達；制備抗CD59多克隆抗體，臺盼藍染色試驗和LDH試驗檢測sp22分子對CD59分子功能的影響，MTT法測定PC一3細胞增殖抑制率。結(jié)果PCR、雙酶切及DNA測序鑒定表明成功構(gòu)建了sp—PIRES真核重組表達載體；RT—PCR試驗證實sp22在

3、spPC一3細胞中成功表達；WesternBlot、ELESA競爭抑制試驗表明：spPC一3細胞比正常PC一3細胞CD59蛋白表達量減少，二者比較其差別有統(tǒng)計學(xué)意義(PO05)；與J下常PC一3細胞相比，補體對spPC3細胞的溶解殺傷能力明顯增強，二者比較其差別有統(tǒng)計學(xué)意義(PO05)；MTT結(jié)果測定spPC一3細胞與正常PC一3細胞相比較細胞增殖抑制率增高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(PO05)。結(jié)論sp22基因可在mRNA及蛋白水平抑制人前列

4、腺癌PC一3細胞表面CD59蛋白分子的表達及功能，降低CD59分子抗補體活性，為進一步研究利用SP22阻斷CD59分子在腫瘤細胞上的表達創(chuàng)造了有利條件，為腫瘤的免疫治療研究奠定基礎(chǔ)。碩士研究生李偉偉(免疫學(xué))指導(dǎo)教師高美華教授關(guān)鍵詞：配體；CD59；真核表達；PC3細胞；補體目錄第一章材料和方法411材料4111主要儀器設(shè)備4112質(zhì)粒、菌株與細胞株4113主要試驗試劑412方法5121sp—pIRES重組表達載體的構(gòu)建及鑒定51211

5、sp22基因序列的選擇與設(shè)計51212引物設(shè)計51213sp—dsDNA的制備一61214sp一18T重組克隆載體的構(gòu)建及鑒定61215sp—pIRES重組表達載體的構(gòu)建及鑒定9122PC一3細胞的轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆的篩選111221PC3細胞的培養(yǎng)111222PC3細胞的轉(zhuǎn)染”111223穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆的建立121224PC3細胞內(nèi)總RNA提取121225sp22RT—PCRmRNA水平篩選陽性細胞克隆131226轉(zhuǎn)染細胞CD5