Slit-Robo信號(hào)通路和芳香烴受體(AhR)在卵巢腫瘤組織及卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)和意義的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 Slit/Robo信號(hào)通路在卵巢腫瘤組織及卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)和意義的實(shí)驗(yàn)研究
　　 研究背景：Slit/Robo家族最早在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)。Slit蛋白是一類分泌性糖蛋白，脊椎動(dòng)物中包括三個(gè)Slit成員(Slit1-3)，它通過受體Roundabout(Robo)發(fā)揮其作為神經(jīng)元遷移的排斥性因子和神經(jīng)軸突導(dǎo)向的作用。哺乳動(dòng)物的Slit蛋白結(jié)構(gòu)由一個(gè)N-端信號(hào)肽，四個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRRs)，九個(gè)EGF樣重復(fù)

2、序列和一個(gè)C-端的半胱氨酸結(jié)組成，LRRs是Slit與受體Robo結(jié)合必需的區(qū)域。Slit在蛋白水解過程中產(chǎn)生N-末端和C-末端兩個(gè)片段，只有全長和N-末端Slit能與細(xì)胞膜受體Robo結(jié)合發(fā)揮作用。Robo屬于免疫球蛋白超家族的跨膜信號(hào)分子，在脊椎動(dòng)物中有四個(gè)成員Robo1-4。Robo1，2，3胞外區(qū)是由5個(gè)Ig樣功能區(qū)和3個(gè)Ⅲ型纖維連接蛋白(Fibronectin)樣結(jié)構(gòu)域組成；Robo4結(jié)構(gòu)與其他成員差異較大，胞外區(qū)只有兩個(gè)Ig

3、樣功能區(qū)。
　　 Slit/Robo在人類多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有表達(dá)，關(guān)于其作用的報(bào)道則是不一致的。有研究表明，Slit/Robo可作為腫瘤抑制因子，例如在肺癌和乳腺癌中可檢測(cè)到ROBO1基因純合子缺失；Slit2可抑制乳腺及直腸腫瘤細(xì)胞的生長，在乳腺癌、肺癌、直腸癌、及腦癌等多種腫瘤中Slit/Robo啟動(dòng)子基因甲基化導(dǎo)致其失去活性；與正常組織或低度惡性腫瘤組織相比，Slit/Robo的表達(dá)在包括肺癌、乳腺癌、宮頸癌及前列腺癌等多

4、種腫瘤中均有下降。與之相反的說法是，某些Slit/Robo成員在很多腫瘤中的表達(dá)明顯增高。Wang等報(bào)道顯示，中和阻斷Robo1可縮小體內(nèi)惡性黑色素瘤體積并降低腫瘤的微血管密度，表明Slit/Robo可通過促進(jìn)血管的生成加劇癌癥的發(fā)生及發(fā)展。因此，依據(jù)不同的腫瘤類型，Slit/Robo發(fā)揮促進(jìn)或者抑制腫瘤發(fā)展的作用。
　　 Slit/Robo在多種腫瘤中的表達(dá)和作用已被探討，且證實(shí)SLIT1、SLIT2、SLIT3、ROBO1基

5、因在一系列上皮性惡性腫瘤中均作為候選腫瘤抑制基因。在卵巢惡性腫瘤中，約90％為上皮性卵巢癌，但是Slit/Robo家族在卵巢腫瘤中的表達(dá)及功能卻未有報(bào)道，鑒于此，首次應(yīng)用卵巢腫瘤組織芯片對(duì)Slit/Robo家族主要成員(Slit2/3及Robo1/4)在正常卵巢組織及不同組織學(xué)類型的卵巢腫瘤組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，并利用增殖和遷移實(shí)驗(yàn)探討Slit/Robo信號(hào)通路是否對(duì)卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3和SKOV-3增殖侵襲能力產(chǎn)生影響。

6、>　　 研究目的：
　　 1.檢測(cè)Slit/Robo信號(hào)通路的主要成員在正常卵巢組織和不同組織學(xué)類型的卵巢惡性腫瘤組織及卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)；
　　 2.探討Slit2對(duì)卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3和SKOV-3增殖、遷移能力的影響；
　　 3.研究Slit2對(duì)卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞內(nèi)ERK1/2和AKT1磷酸激酶的影響。
　　 研究方法：
　　 1.免疫組織化學(xué)方法：檢測(cè)在正常

7、卵巢組織和不同組織學(xué)類型的卵巢惡性腫瘤中Sti2/3和Robo1/4的表達(dá)，分別以山羊和兔IgG代替一抗作為陰性對(duì)照；采用半定量法判定結(jié)果，使用ImageJ和Meta Morph圖像分析軟件測(cè)得圖片OD值；SigmaStat統(tǒng)計(jì)軟件分析不同組織學(xué)類型腫瘤組織之間數(shù)值的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　 2.Western Blot分析法：檢測(cè)在人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞中Slit2/3和Robo1/4蛋白的表達(dá)；以GAPDH

8、和β-actin作為內(nèi)參照物；
　　 3.24孔-Transwell系統(tǒng)：檢測(cè)Slit2處理后卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞的侵襲能力；
　　 4.結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)Slit2處理后卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞的增殖能力；
　　 5.細(xì)胞劃痕試驗(yàn)：檢測(cè)Slit2處理后卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞的增殖遷移能力；
　　 6.Western Blot分析法：檢測(cè)Sl

9、it2處理后卵巢癌細(xì)胞內(nèi)ERK1/2和AKT1的磷酸化水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.Slit2/3和Robo1/4在正常卵巢組織和卵巢腫瘤組織中的表達(dá)：8例正常卵巢組織和8例癌旁正常組織合為一組稱正常對(duì)照組，共16例，各不同組織學(xué)類型的卵巢惡性腫瘤組織稱為研究組，共192例。在對(duì)照組中可檢測(cè)到Slit2、Slit3和Robo1呈不同程度的陽性表達(dá)，主要分布在卵巢基質(zhì)細(xì)胞；在研究組中Slit2/3和Robo1/4可見不同

10、程度的陽性表達(dá)；陰性對(duì)照組均未見有著色。
　　 1)Slit2：在正常對(duì)照組、高低級(jí)別漿液性囊腺癌、卵黃囊瘤、顆粒細(xì)胞瘤和無性細(xì)胞瘤中可見陽性著色(OD>2000±680)，陽性率分別為75％(12/16)，69％(79/115)，100％(21/21)，100％(6/6)，75％(3/4)和80％(4/5)。正常對(duì)照組中OD=1971±681，在低級(jí)別漿液性囊腺癌中OD=6048±2216，卵黃囊瘤OD=4797±1369，統(tǒng)

11、計(jì)分析結(jié)果顯示OD值增高較正常對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 2)Slit3：無性細(xì)胞瘤OD=17562±4463，陽性率為100％(5/5)；卵黃囊瘤OD=16627±6986，陽性率為100％(6/6)。正常對(duì)照組OD=1248±789，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示在無性細(xì)胞瘤和卵黃囊瘤中OD值增高較對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 3)Robo1：在對(duì)照組和研究組均有較強(qiáng)陽性著色(OD>9640±640)，陽性率均為100％。低

12、級(jí)別漿液性囊腺癌OD=33025±3513，高級(jí)別漿液性囊腺癌OD=23268±1744，粘液性囊腺癌OD=15336±2213，無性細(xì)胞瘤OD=32667±9646，卵黃囊瘤OD=40824±4033，與正常對(duì)照組OD=9640±640相比，OD值明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 4)Robo4：無性細(xì)胞瘤OD=7100±6200，陽性率為80％(4/5)；卵黃囊瘤OD=1570±6980，陽性率為100％(6/6)。與正常

13、對(duì)照組OD=452±301相比，OD值明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.Slit2/3和Robo1/4蛋白在人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞中的表達(dá)：Slit2抗體在～50KDa左右檢測(cè)到蛋白條帶，該位置對(duì)應(yīng)于Slit2 C-末端，與陽性對(duì)照(human hepatoblastoma cells)一致；Slit3抗體在～45和～65KDa左右檢測(cè)到蛋白條帶，對(duì)應(yīng)于Slit3 C-末端，與陽性對(duì)照(mouse

14、thyroid extract)結(jié)果一致；均未檢測(cè)到全長Slit2/3(～200KDa)和N-末端(～140KDa)。Robo1/4抗體分別在～250KDa和～170KDa左右檢測(cè)到蛋白條帶，對(duì)應(yīng)于全長Robo1/4。
　　 3.人重組Slit2蛋白對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞增殖侵襲能力的影響：5，10，100 ng/ml Slit2蛋白作用4 d后，與對(duì)照組(增殖率為100％)相比，OVCAR-3細(xì)胞的增殖

15、率分別為111％，113％，113％；SKOV-3細(xì)胞增殖率分別為109％，103％，97％；與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。100 ng/ml Slit2蛋白處理OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞16h后，SKOV-3細(xì)胞遷移數(shù)目為985±77，對(duì)照組為1020±84，兩組相比細(xì)胞遷移數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；OVCAR-3細(xì)胞無遷移。
　　 4.人重組Slit2蛋白對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞內(nèi)E

16、RK1/2和AKT1磷酸激酶的影響：Slit2蛋白處理細(xì)胞0，10m，30m，1h，3h后，與對(duì)照組(設(shè)為1)相比，OVCAR-3細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平分別為1.0±0.0，2.4±0.9，1.5±0.7，1.3±0.3，1.8±0.7；AKT1磷酸化水平分別為1.0±0.0，3.4±2.1，3.3±1.8，2.7±0.8，2.9±1.3；SKOV-3細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平分別為1.0±0.0，1.2±0.3，2.1±0.7

17、，2.2±1.0，1.3±0.4；AKT1磷酸化水平分別為1.0±0.0，1.1±0.4，1.8±0.9，1.0±0.2，1.0±0.3。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.Slit/Robo信號(hào)通路中主要成員Slit2/3和Robo1/4在卵巢癌組織中的陽性表達(dá)顯著高于正常卵巢組織中的表達(dá)水平；
　　 2.人重組Slit2蛋白對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞生長增殖

18、、侵襲遷移能力無明顯促進(jìn)作用；
　　 3.人重組Slit2蛋白未激活卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞內(nèi)ERK1/2和AKT1磷酸激酶。
　　 第二部分芳香烴受體(AhR)在卵巢腫瘤組織中表達(dá)及對(duì)卵巢癌細(xì)胞系增殖遷移能力影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　 研究背景：芳香烴受體(AhR)是一類配體激活轉(zhuǎn)錄因子，它在細(xì)胞外信號(hào)激活下，通過DNA結(jié)合調(diào)控相應(yīng)的基因表達(dá)，可介導(dǎo)多環(huán)芳烴類化合物的毒性反應(yīng)(包括致癌性)，還參與

19、一些重要的生物學(xué)過程，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等。未與配體結(jié)合的情況下大部分AhR位于細(xì)胞胞漿內(nèi)，配體結(jié)合后，通過芳香烴受體核轉(zhuǎn)因子(ARNT)，AhR被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核。細(xì)胞核內(nèi)的AhR與DNA上的AhR增強(qiáng)子序列反應(yīng)元件(DRE)結(jié)合，可激活包括細(xì)胞色素酶如CYP1A1，CYP1A2和CYP1B1等下游基因的表達(dá)。CYP1A1，CYP1A2和CYP1B1是三種被廣泛研究的外源性物質(zhì)代謝酶，其功能主要是降解外源性有毒物質(zhì)。同時(shí)AhR

20、還會(huì)激活p53和p21等基因，從而影響細(xì)胞周期調(diào)控，以及細(xì)胞生長。
　　 已有研究表明2-(1’H-吲哚-3’-羰基)噻唑-4-羧酸甲酯[2-(1’H-indole-3’-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester，ITE]是內(nèi)源性的AhR配體，最早是從豬的肺組織中提取的。ITE可結(jié)合AhR，激活含DRE的DNA序列的報(bào)告基因，其生物效價(jià)是BNF(人工合成AhR配體)的5倍

21、。此外，在小鼠肝癌細(xì)胞中，ITE的活性可達(dá)到TCDD的5-6倍。由于ITE是自然代謝產(chǎn)物無毒性作用，并能高效結(jié)合AhR，因此可作為一種潛在的抗癌藥物。雖然AhR在人類卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的功能仍然不清楚，但AhR在人類卵巢癌中有高表達(dá)并且其配體TCDD可以刺激卵巢癌細(xì)胞系CAOV-3的增殖等現(xiàn)象均表明AhR在卵巢癌進(jìn)展過程中發(fā)揮一定的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)我們對(duì)AhR及其配體ITE在卵巢癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的作用進(jìn)行探討。
　　 研究目

22、的：
　　 1.檢測(cè)AhR在正常卵巢組織及不同組織學(xué)類型的卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)，并探討其臨床意義；
　　 2.探討ITE對(duì)人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。
　　 研究方法：
　　 1.組織芯片免疫組織化學(xué)方法：檢測(cè)在正常卵巢組織和不同組織學(xué)類型的卵巢惡性腫瘤中AhR的表達(dá)。采用半定量法判定結(jié)果，使用Image J和Meta Morph圖像分析軟件測(cè)得圖片OD值；Si

23、gma Stat統(tǒng)計(jì)軟件分析不同組織學(xué)腫瘤組織之間數(shù)值的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　 2.結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)ITE處理后OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞的生長增殖能力；
　　 3.24孔-transwell系統(tǒng)：檢測(cè)TTE處理后OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞的遷移能力。
　　 結(jié)果：
　　 1.AhR在正常卵巢組織和卵巢腫瘤組織中的表達(dá)：8例正常卵巢組織和8例癌旁正常組織合為一組稱正常對(duì)照組，共16例，各不同組織學(xué)

24、類型的卵巢惡性腫瘤組織稱為研究組，共192例。正常對(duì)照組AhR表達(dá)陰性；在192例不同組織學(xué)類型的卵巢惡性腫瘤組織中AhR有陽性表達(dá)，主要分布在上皮細(xì)胞包漿內(nèi)；陰性對(duì)照組均未見有陽性著色。漿液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、卵黃囊瘤、惡性畸胎瘤中可見較強(qiáng)陽性著色(OD≥5476±1864)，陽性率分別為75％(102/136)，60％(12/20)，83％(5/6)，100％(5/5)。在低級(jí)別漿液性囊腺癌中OD=17140±1509，高級(jí)別漿

25、液性囊腺癌OD=12610±1469，粘液性囊腺癌OD=7416±2214，卵黃囊瘤OD=5880±2183，惡性畸胎瘤OD=5476±1864，OD值較正常對(duì)照組(OD=511±103)升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 2.ITE對(duì)卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞的生長抑制作用：0.1nM，1nM，10 nM，100 nM，1uM，5uM ITE處理細(xì)胞2天后，OVCAR-3細(xì)胞增殖率分別為88％，79％，78％，77％，7

26、7％，89％，與對(duì)照組(100％)相比ITE抑制作用不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ITE處理細(xì)胞4天后，OVCAR-3細(xì)胞增殖率分別為73％，54％，52％，52％，49％，56％；6天后OVCAR-3細(xì)胞增殖率分別為60％，38％，31％，33％，33％，39％；與對(duì)照組(100％)相比，ITE對(duì)細(xì)胞生長抑制作用明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.1nM-5uM ITE處理細(xì)胞2天后，SKOV-3細(xì)胞增殖率分別為105％，106％，109％，118％

27、，108％，104％；4天后為102％，102％，103％，105％，102％，101％；6天后為100％，100％，99％，98％，100％，101％，與對(duì)照組(100％)相比，ITE對(duì)SKOV-3細(xì)胞抑制作用不明顯，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 3.ITE對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3侵襲遷移能力的影響：1uM ITE處理SKOV-3細(xì)胞2，4，6天后，SKOV-3細(xì)胞遷移數(shù)目分別為57±2，54±3，50±8，與對(duì)照組