腫瘤抑制基因的DNA甲基化在肝移植后肝癌復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)中的價(jià)值研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見(jiàn)的肝臟惡性腫瘤，占全世界腫瘤發(fā)生率的第五位。我國(guó)作為乙肝大國(guó)，國(guó)民中乙型肝炎病毒攜帶率高，作為肝炎-肝硬化-肝癌這一進(jìn)展鏈的終末端，肝癌的高發(fā)成為不爭(zhēng)的事實(shí)，從而使我國(guó)成為全世界肝癌的最高發(fā)地區(qū)之一。不可否認(rèn)的是，經(jīng)過(guò)幾十年的不斷努力，我國(guó)在肝癌的診治上取得了舉世矚目的成就。但是以手術(shù)切除為基礎(chǔ)的各種綜合治療（包括放射、化學(xué)、生物、靶向、肝移植等治療手段）依然

2、無(wú)法解決HCC總體預(yù)后不佳這一難題。隨著肝臟外科水平的進(jìn)步和肝癌受者入選標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步規(guī)范，肝臟移植被認(rèn)為是治療肝癌的一種理想治療手段，但是肝臟移植術(shù)后腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)這個(gè)瓶頸問(wèn)題依然嚴(yán)重制約肝癌的治療效果。近年來(lái)，圍繞肝移植后肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移這一核心問(wèn)題，有關(guān)預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)的生物學(xué)標(biāo)記的研究不斷升溫，成為重要的研究方向。
　　 隨著對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移認(rèn)識(shí)的不斷深入和人類基因組學(xué)的長(zhǎng)足發(fā)展，人們已經(jīng)意識(shí)到肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及到多基因改變、調(diào)控

3、的復(fù)雜過(guò)程，基于惡性腫瘤基因改變、調(diào)控的相關(guān)研究成為熱點(diǎn)。而作為新興的表觀遺傳學(xué)最重要的研究?jī)?nèi)容，DNA甲基化所致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活，進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展這一問(wèn)題也成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。然而，通過(guò)文獻(xiàn)回顧發(fā)現(xiàn)，目前有關(guān)新腫瘤抑制基因PCDH10以及基于多個(gè)腫瘤抑制基因同時(shí)甲基化的分子表型——CpG島甲基化表型(CpG islands methylator phenotype CIMP)在肝移植后肝癌復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)中的價(jià)值國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道，因此我

4、們此前研究的基礎(chǔ)上，首次嘗試建立一個(gè)能反映肝癌生物學(xué)特征的CpG島甲基化表型，探討其在肝移植后肝癌復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)中的價(jià)值；并以新型TSG-PCDH10作為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究作為優(yōu)化的CIMP的候選TSG在肝細(xì)胞肝癌進(jìn)展中的作用及其調(diào)控機(jī)制，以期建立一個(gè)與復(fù)發(fā)密切相關(guān)的CIMP模型，為進(jìn)一步提高肝癌肝移植的早期復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)能力，建立肝癌肝移植“中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)”提供候選的新的腫瘤生物學(xué)參數(shù)。
　　 第一部分：腫瘤抑制基因的DNA甲基化及相關(guān)CpG島

5、甲基化表型對(duì)肝移植后肝癌復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的價(jià)值研究
　　 目的：
　　 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化是最重要的表觀遺傳修飾，通過(guò)結(jié)合甲基化結(jié)合域(MBD)和組蛋白乙?；芤鸹虻谋磉_(dá)沉默，尤其是抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮了非常重要的作用。肝癌中多個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)的協(xié)同甲基化所形成的CpG島的甲基化表型被證實(shí)與肝癌病理，如甲胎蛋白的升高有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)肝癌中多基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化，觀察腫瘤相關(guān)基因甲基

6、化在肝癌中的發(fā)生情況，建立與肝移植肝癌復(fù)發(fā)預(yù)后相關(guān)CpG島甲基化表型，并分析CpG島甲基化表型與臨床病理指標(biāo)之間的聯(lián)系。
　　 方法：
　　 選取P16, CDH1, GSTP1, DAPK, MGMT, XAF1, TIMP3, SOCS1, SFRP1, TMS1, SYK, DKK1共12個(gè)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島上甲基化位點(diǎn)（上述基因已知可能與人類不同惡性腫瘤，特別是消化道腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移乃至預(yù)后相關(guān)

7、），應(yīng)用甲基化特異性PCR(MethylaTiO2-Specific PCR)首先對(duì)小規(guī)模20例HCC肝移植病人的病肝組織DNA進(jìn)行甲基化狀況的初篩，將其中甲基化頻率高于40％的7個(gè)腫瘤抑制基因(P16, CDH1, GSTP1, DAPK, XAF1, SOCS1, SYK)作為CpG島甲基化表型的標(biāo)志基因，并將上述位點(diǎn)的甲基化檢測(cè)擴(kuò)大到65例HCC肝移植病人的病肝組織DNA樣本，然后根據(jù)甲基化狀況的不同對(duì)65例病人進(jìn)行CpG島的甲基

8、化表型(CIMP)分類；另一方面對(duì)肝癌肝移植病人進(jìn)行臨床病理資料的收集，對(duì)病人進(jìn)行隨訪，比較不同CpG島甲基化表型與病人臨床病理指標(biāo)及移植術(shù)后的3年無(wú)復(fù)發(fā)生存之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 所檢測(cè)的臨床樣本中12個(gè)基因的甲基化頻率各不相同：從MGMT的5％到XAF1的66％不等；所選擇的7個(gè)CpG島甲基化表型的標(biāo)志基因中，存在協(xié)同甲基化現(xiàn)象，即P16與SYK同時(shí)甲基化(P=0.001)，P16與CDH1同時(shí)甲基化(P=

9、0.008)，CDH1與DAPK同時(shí)甲基化(P=0.003)。在分析了單個(gè)腫瘤抑制基因與臨床病理學(xué)指標(biāo)及預(yù)后信息后發(fā)現(xiàn)：GSTP1的高甲基化與低組織學(xué)分級(jí)(P=0.003)和多發(fā)的腫瘤個(gè)數(shù)有關(guān)(P=0.011)；XAF1的高甲基化與病人術(shù)前AFP水平存在相關(guān)性(P=0.007)，此外DAPK的甲基化狀況與腫瘤的大小也存在一定的聯(lián)系(P=0.016)，但其他單個(gè)基因的甲基化狀況與病人的臨床病理學(xué)指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且所有單個(gè)基因的甲基化

10、狀況與病人的復(fù)發(fā)預(yù)后也無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)，分析甲基化數(shù)目與復(fù)發(fā)生存的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在所選擇的7個(gè)抑癌基因中，大于等于3個(gè)基因發(fā)生甲基化與肝移植后肝癌復(fù)發(fā)具有最顯著的相關(guān)性(P=0.004)，因而將CpG島的甲基化表型(CIMP)分類為CIMP陽(yáng)性（甲基化數(shù)目大于等于3個(gè)）和CIMP陰性（甲基化數(shù)目小于3個(gè)）。隨后的分析發(fā)現(xiàn)，CpG島的甲基化表型狀態(tài)與術(shù)前AFP水平和腫瘤大小存在相關(guān)性(P值分別為0.0

11、17和0.007)，但與病人的其它臨床病理學(xué)指標(biāo)如性別、年齡、是否合并門(mén)靜脈癌栓(PVTT)、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小均無(wú)關(guān)(P＞0.05)。同時(shí)，結(jié)合我們中心之前提出的肝移植杭州標(biāo)準(zhǔn)，證實(shí)超越杭州標(biāo)準(zhǔn)的病人比符合杭州標(biāo)準(zhǔn)的病人具有更高的CIMP陽(yáng)性發(fā)生率(84％ vs.57％，P=0.017)。之后我們運(yùn)用Kaplan-Meier生存曲線分析CpG島的甲基化表型與肝癌肝移植病人生存期關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)CpG島的甲基化表型陽(yáng)性組(CIMP+)的病人

12、的移植后三年無(wú)復(fù)發(fā)生存期比CpG島的甲基化表型陰性組(CIMP-)病人要短，且具有顯著性差異(15.3月vs.30.3月，P=0.004)。Cox單因素分析結(jié)果顯示：除了術(shù)前AFP水平、腫瘤大小以外，CpG島的甲基化表型狀態(tài)也與復(fù)發(fā)顯著相關(guān)。多因素分析結(jié)果表明：除腫瘤大小外，CpG島的甲基化表型狀態(tài)（危險(xiǎn)系數(shù)：3.581；95％可信區(qū)間：(1.473-8.710); P=0.005）也是影響復(fù)發(fā)的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。
　　 結(jié)論

13、：
　　 CpG島的甲基化表型是影響移植后肝癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)移植后肝癌復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)具有潛在的重要價(jià)值。
　　 第二部分：新腫瘤抑制基因PCDH10在肝細(xì)胞肝癌中的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：
　　 原鈣粘蛋白10(PCDH10)，是新近發(fā)現(xiàn)的鈣粘蛋白超家族的一名成員蛋白。早期關(guān)于PCDH10的研究主要集中在神經(jīng)生理方面，認(rèn)為PCDH10蛋白在大腦發(fā)育，特別是紋狀體軸突延伸和丘腦皮質(zhì)投射的形成中發(fā)揮了重要作

14、用。最近有研究表明，在鼻咽癌，白血病，宮頸癌，乳腺癌和胃癌等多種腫瘤細(xì)胞株和組織中存在由于PCDH10基因啟動(dòng)子的異常甲基化而導(dǎo)致表達(dá)缺失現(xiàn)象，而通過(guò)外源性的過(guò)度表達(dá)PCDH10蛋白能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。在宮頸癌的研究中則認(rèn)為PCDH10的甲基化可以作為宮頸癌特異性診斷的一個(gè)潛在的標(biāo)志物。而在胃癌的最新臨床研究中不僅證實(shí)PCDH10是一個(gè)典型的腫瘤抑制基因，而且PCDH10的高甲基化和病人不良預(yù)后

15、有著密切的聯(lián)系。但PCDH10在肝癌中的臨床和基礎(chǔ)研究目前尚未報(bào)道，PCDH10蛋白在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能也還不得而知。
　　 方法：
　　 采用Western blotting和免疫組化的方法檢測(cè)PCDH10在HCC患者腫瘤組織，癌旁以及正常肝臟組織中蛋白表達(dá)情況。用RT-PCR方法檢測(cè)去甲基化藥物(5’-Aza-dC)用藥前后肝癌細(xì)胞株中PCDH10的mRNA表達(dá)水平，研究其表觀遺傳的調(diào)控機(jī)制，同時(shí)采用甲基化特異性

16、PCR(MSP)和重亞硫酸鹽修飾測(cè)序PCR(BSP)的方法驗(yàn)證目的基因的甲基化變化情況，并分析65例肝癌肝移植患者的PCDH10的甲基化狀況與臨床病理指標(biāo)及復(fù)發(fā)預(yù)后的相關(guān)性；應(yīng)用RNA干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別模擬PCDH10缺失和過(guò)表達(dá)兩種情況，進(jìn)而從正反兩方面來(lái)研究PCDH10蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和克隆形成能力的影響。
　　 結(jié)果：
　　 在我們所選的5種不同肝癌細(xì)胞株中，80％肝癌細(xì)胞株存在PCDH10mR

17、NA表達(dá)水平的降低或缺失，而PCDH10基因的啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化則是引起基因表達(dá)缺失的主要原因。臨床組織標(biāo)本中則發(fā)現(xiàn)DNA甲基化導(dǎo)致的PCDH10蛋白表達(dá)缺失具有腫瘤特異性，即肝癌組織中的表達(dá)相對(duì)于癌旁組織和正常組織普遍降低，并且發(fā)現(xiàn)PCDH10基因高甲基化的肝癌肝移植病人更容易發(fā)生術(shù)后的腫瘤復(fù)發(fā)，且預(yù)后不良。體外實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)，PCDH10的過(guò)度表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞株的增殖，降低細(xì)胞的侵襲和克隆形成能力，并誘導(dǎo)凋亡。
　　 結(jié)論