長鏈非編碼RNA在肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)后中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，中國人群中的慢性乙型肝炎病毒感染率高，使得我國占到了全球每年新發(fā)病例的55％，成為全世界肝癌最高發(fā)的地區(qū)之一。肝移植作為一種潛在的肝癌根治性手段，不僅能完整切除腫瘤，而且糾正嚴(yán)重的肝硬化，但是肝移植術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移嚴(yán)重地制約了患者的長期生存，因此，有效防治肝癌肝移植術(shù)后的腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為急需解決的瓶頸問題。
　　第一部分肝癌肝移植組織中長鏈非編碼RNA的鑒定
　　目的:
　　

2、通過對肝癌肝移植樣本的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，特別是在腫瘤特異性長鏈非編碼RNA方面的研究，進(jìn)而對肝細(xì)胞癌的異質(zhì)性及生物學(xué)機(jī)制有一個更加全面的認(rèn)識。
　　方法:
　　入選10例接受肝移植手術(shù)的肝癌患者樣本，病人的病理資料及臨床數(shù)據(jù)完整。提取RNA后，采用solexa測序技術(shù)，對癌及癌旁組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，應(yīng)用生物信息學(xué)手段進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:
　　我們分析了10例肝癌及配對癌旁組織的長鏈非編碼RNA的表達(dá)情況，根據(jù)F

3、old Change≥2-fold和FDR≤0.05，且在5例以上樣本中有表達(dá)差異的標(biāo)準(zhǔn)，共篩選到17個具有表達(dá)差異的lncRNA（已注釋）。隨后，進(jìn)行染色體上位置的標(biāo)注，發(fā)現(xiàn)它們大部分位于肝細(xì)胞癌染色體的雜合性缺失或擴(kuò)增區(qū)域。
　　結(jié)論:
　　在肝癌肝移植組織中篩選到的17個差異表達(dá)的長鏈非編碼RNA，為進(jìn)一步深入研究其表達(dá)模式及功能奠定基礎(chǔ)，為肝癌肝移植術(shù)后預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供新思路和新方法。
　　第二部分基于轉(zhuǎn)錄組測

4、序篩選的新型長鏈非編碼RNA HOTTIP在移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)中的作用及分子機(jī)制研究
　　目的:
　　肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)是一個在多個水平上發(fā)生多基因改變的復(fù)雜過程。研究報道長鏈非編碼RNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。我們在前期完成了10對肝癌組織及配對癌旁組織樣本的轉(zhuǎn)錄組測序后，篩選出一個與肝癌相關(guān)的新型長鏈非編碼RNA HOTTIP。本研究探討HOTTIP在肝癌中的表達(dá)模式，生物學(xué)功能及其對肝癌肝移植

5、術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測價值。
　　方法:
　　實時定量PCR檢測肝癌肝移植病人腫瘤組織中HOTTIP的表達(dá)模式并分析其表達(dá)水平與肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系。在體外實驗中，應(yīng)用小干擾RNA特異性降低HOTTIP的表達(dá)后，觀察肝癌細(xì)胞活性、凋亡、侵襲能力等惡性生物學(xué)行為的變化。應(yīng)用人全基因組表達(dá)譜芯片研究HOTTIP表達(dá)降低后對基因表達(dá)的影響，篩選和驗證潛在下游靶點。
　　結(jié)果:
　　HOTTIP在Huh7、MHCC97H

6、、MHCC97L肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)較正常肝細(xì)胞系明顯增高，同時HOTTIP在肝癌組織中較癌旁組織顯示了明顯的高表達(dá)。肝癌組織中HOTTIP高表達(dá)者移植術(shù)后腫瘤無復(fù)發(fā)生存率及總體生存率較低表達(dá)者明顯降低，同時在超越米蘭標(biāo)準(zhǔn)的肝癌肝移植病人中，HOTTIP高表達(dá)者也顯示了較低的術(shù)后無復(fù)發(fā)生存率。多因素分析顯示HOTTIP高表達(dá)是肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)及預(yù)后的獨立危險因素。體外研究表明，小于擾RNA降低肝癌細(xì)胞HOTTIP的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的

7、侵襲能力明顯減弱，同時也增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對多柔比星、依托泊苷及奧沙利鉑的化療敏感性。表達(dá)譜芯片及生物信息學(xué)分析提示W(wǎng)NT信號通路可能是HOTTIP介導(dǎo)的一條重要通路。進(jìn)一步的驗證表明下調(diào)HOTTIP的表達(dá)能顯著降低肝癌細(xì)胞非經(jīng)典WNT通路中Wnt-5α的表達(dá)水平。
　　結(jié)論:
　　HOTTIP是肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一個重要分子，介導(dǎo)Wnt-5α通路調(diào)控肝癌細(xì)胞抗凋亡、化療增敏、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為。HOTTIP的表達(dá)可作為一個

8、預(yù)測肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。
　　第三部分 長鏈非編碼RNA HOTAIR通過RNA結(jié)合蛋白38調(diào)控肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移并預(yù)測移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)
　　目的:
　　長鏈非編碼RNA在表觀遺傳學(xué)修飾中發(fā)揮重要作用。本研究目標(biāo)為闡明長鏈非編碼RNA家族新成員HOTAIR在肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)功能及其表觀遺傳學(xué)改變，揭示HOTAIR表觀遺傳調(diào)控肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　方法:
　　通過實時定

9、量PCR檢測HOTAIR在肝癌組織中的表達(dá)，研究HOTAIR與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系;應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)降低HOTAIR基因的表達(dá)，研究其降低對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用;應(yīng)用人全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)研究HOTAIR表觀調(diào)控的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　HOTAIR在BEL-7402、HepG2等肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)較正常肝細(xì)胞系明顯增高。體外研究表明，小干擾RNA降低肝癌細(xì)胞HOTAIR的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的活力、

10、遷移和侵襲能力明顯減弱，同時也增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對TNF-α介導(dǎo)的凋亡及順鉑、多柔比星等化療藥物的敏感性。應(yīng)用人全基因組表達(dá)譜芯片和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)眾多RNA結(jié)合蛋白參與其中。對siHOTAIR進(jìn)行下游基因的篩選驗證，我們發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白38是HOTAIR表觀調(diào)控的潛在下游分子。HOTAIR通過下調(diào)RBM38的表達(dá)從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。臨床樣本研究顯示:HOTMR在肝癌組織中較癌旁組織顯著高表達(dá)。肝癌組織中HOTAIR高表達(dá)者

11、預(yù)示肝癌肝移植術(shù)后無復(fù)發(fā)生存率及總體生存率較低。Cox多因素分析顯示HOTAIR高表達(dá)是預(yù)測肝癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的獨立的危險因素。在超越米蘭標(biāo)準(zhǔn)的肝癌肝移植病人中，HOTAIR高表達(dá)者也顯示了較低的術(shù)后無復(fù)發(fā)生存率及總體生存率。
　　結(jié)論:
　　HOTAIR參與調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、化療增敏、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為。HOTAIR通過下調(diào)RBM38的表達(dá)從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。HOTAIR對肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)及預(yù)后預(yù)

12、測具有潛在的臨床應(yīng)用價值。
　　第四部分長鏈非編碼RNA PCAT-1在肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)后中的預(yù)測作用
　　目的:
　　肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)是亟待解決的瓶頸問題。然而目前還缺乏有效的預(yù)測分子。本研究旨在闡明PCAT-1在肝癌中的表達(dá)水平，臨床意義及生物學(xué)功能。
　　方法:
　　我們通過實時熒光定量PCR檢測184例肝癌肝移植病人腫瘤組織中PCAT-1的表達(dá)模式，并分析其表達(dá)水平與肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、

13、生存的關(guān)系。在體外實驗中，應(yīng)用小干擾RNA特異性降低BEL-7402肝癌細(xì)胞株P(guān)CAT-1的表達(dá)后，觀察肝癌細(xì)胞增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為的變化。
　　結(jié)果:
　　與癌旁組織相比，PCAT-1在肝癌組織中的表達(dá)明顯增高，臨床病理關(guān)聯(lián)分析顯示PCAT-1的表達(dá)水平與腫瘤數(shù)目、大小、術(shù)前AFP、臨床病理分級等均無關(guān)。Cox多因素分析顯示PCAT-1的高表達(dá)是肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因素。同時在符合米蘭標(biāo)準(zhǔn)的肝癌肝移植病人