上皮性卵巢癌多腫瘤抑制基因異常甲基化的研究.pdf

1、上皮性卵巢癌的發(fā)生是表遺傳學(xué)與遺傳學(xué)機(jī)制共同參與的涉及多基因改變、通過(guò)多階段變異累積形成的病理過(guò)程。目前，在其發(fā)生機(jī)制中，DNA 啟動(dòng)子區(qū)CpG 島異常甲基化是一個(gè)研究熱點(diǎn)。表遺傳學(xué)是研究沒(méi)有 DNA 序列變化、可遺傳的基因表達(dá)的改變，表遺傳學(xué)的分子機(jī)制包括 DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)改型和RNA干涉等，它們?cè)诨蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中起重要作用。作為表遺傳學(xué)機(jī)制的重要內(nèi)容，DNA 甲基化是基因突變及缺失之外腫瘤抑制基因失活的第三種機(jī)制

2、，DNA 甲基化異常在多種腫瘤的發(fā)生中起重要作用。已有研究表明，腫瘤中異常甲基化的基因包括參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化、凋亡調(diào)控及腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成相關(guān)基因等。DNA 甲基化和組蛋白乙?；潜磉z傳學(xué)調(diào)控基因表達(dá)的兩種主要方式，DNA 低甲基化和組蛋白乙?；纱龠M(jìn)基因表達(dá)，DNA 高甲基化和組蛋白去乙酰化可抑制基因表達(dá)，DNA 甲基化和組蛋白乙酰化相互影響。 卵巢惡性腫瘤是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，上皮性卵巢癌占卵巢惡性腫瘤85％

3、-90％，DNA 甲基化在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。若干腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化與上皮性卵巢癌的形成密切相關(guān)，研究表明，DNA甲基化酶抑制劑及組蛋白脫乙?；敢种苿┛赡苡糜趷盒阅[瘤的臨床治療，包括上皮性卵巢癌在內(nèi)。對(duì)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化的深入研究不僅有助于揭示上皮性卵巢癌的發(fā)生機(jī)制，而且可能促進(jìn)上皮性卵巢癌臨床診斷和治療的發(fā)展。 本研究旨在探討上皮性卵巢癌與表遺傳學(xué)的關(guān)系，選擇與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控

4、、DNA 修復(fù)及化療耐藥相關(guān)的基因 RASSF1A、BRCA1、p16、hMLH1發(fā) MGMT，研究的第一部分首先通過(guò)檢測(cè)基因啟動(dòng)子區(qū) CpG 島甲基化狀態(tài)及其蛋白表達(dá)，尋找上皮性卵巢癌相關(guān)的異常甲基化基因，進(jìn)一步分析基因蛋白表達(dá)及與啟動(dòng)子區(qū)甲基化的相關(guān)性，及與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。研究的第二部分從與遺傳學(xué)發(fā)生機(jī)制相結(jié)合的角度，分析上皮性卵巢癌組織中 MSI 狀態(tài)，以及上述抑癌基因啟動(dòng)子甲基化及蛋白表達(dá)與MSI之間的相關(guān)性，探討 MMR

5、 基因hMLH1啟動(dòng)子甲基化與 MSI 的相關(guān)性以及在上皮性卵巢癌發(fā)生及發(fā)展中的作用。研究的第三部分以前兩部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇甲基化酶抑制劑 5-Aza-CdR 及脫乙?；敢种苿㎞aB兩種藥物，在觀察卵巢癌細(xì)胞系生長(zhǎng)抑制的同時(shí)，分析五個(gè)抑癌基因啟動(dòng)子區(qū) CpG 島甲基化狀態(tài)、mRNA 及蛋白表達(dá)的改變，探討藥物調(diào)控的意義及潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。材料與方法一、實(shí)驗(yàn)材料中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科、遼寧省腫瘤醫(yī)院婦科 1999-200

6、6 年手術(shù)治療63例原發(fā)散發(fā)性上皮性卵巢癌組織、41 例相應(yīng)的盆腹腔轉(zhuǎn)移灶、10 例癌旁卵巢組織及 20 例正常卵巢組織；上皮性卵巢癌細(xì)胞株：CAOV3 及 OVCaR3(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室)，HO-8910(上海腫瘤細(xì)胞研究所)，A2780(天津血液病學(xué)研究所)； RNA 提取試劑 TRIZOL Reagent(GIBCO BRL 公司)，甲基化酶抑制劑 5-aza-2’-deoxycitydine(5-Aza-CdR)及脫乙

7、?；敢种苿?Sodium Butyrate(NaB)(Sigma)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa)，Wizard DNA Clean-up(Promega 公司)，Annexin-v-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)，RASSF1A 羊抗人多克隆抗體、BRCA1 兔抗人多克隆抗體、P16 鼠抗人單克隆抗體(Santa cruz)，hMLH1 兔抗人單克隆抗體及 MGMT 鼠抗人單克隆抗體(Neomarkers)