食管鱗癌中腫瘤相關(guān)基因的甲基化研究.pdf

1、第一部分食管鱗癌甲基化譜及其作為腫瘤標(biāo)志物的研究
　　 背景:
　　 近年來(lái)DNA高度甲基化被公認(rèn)為是食管鱗癌發(fā)病的最常見(jiàn)分子機(jī)制之一。然而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在參與這種分子異常改變中的重要作用和多基因的高度甲基化作為新型腫瘤標(biāo)志物的潛在可能性仍然不清楚。
　　 方法:
　　 本文通過(guò)甲基化特異性PCR研究了47例食管鱗癌患者癌與癌旁正常組織中12個(gè)腫瘤相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài),并通過(guò)亞硫酸鹽測(cè)序的方法進(jìn)

2、一步證實(shí)甲基化CpG位點(diǎn)的存在。為了評(píng)價(jià)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與DNA高度甲基化譜的關(guān)系,通過(guò)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析了三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因(DNMT1,DNMT3a和DNMT3b)的mRNA表達(dá)水平,并通過(guò)免疫組織化學(xué)進(jìn)一步分析了DNMT3b蛋白表達(dá)水平。為了探討腫瘤相關(guān)基因甲基化作為腫瘤標(biāo)志物的可能性,通過(guò)甲基化熒光定量PCR分析了45例食管鱗癌患人和15例正常對(duì)照健康人中5個(gè)高甲基化基因(p16,CDH1,RASSF1A,DAPK,

3、和RAR-β)在血清游離DNA中的甲基化水平。
　　 結(jié)果:
　　 97.9％(46/47)的食管鱗癌組織至少存在一個(gè)基因發(fā)生高度甲基化。在腫瘤組織中單個(gè)基因的甲基化頻率依次為:RAR-β為46.8％；DAPK為46.8％；p16為44.7％；CDH1為42.6％；RASSF1A為14.9％；p14為14.9％;TIMP-3為14.9％；APC為12.8％；MGMT為12.8％；FHIT為6.4％；GSTP1和ADAM2

4、3為0％,而在癌旁正常組織中未發(fā)現(xiàn)高的甲基化頻率。多個(gè)基因的甲基化與病人一些臨床病理特征顯著相關(guān)。在腫瘤組織中,DNMT3b的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織(P=0.005和P<0.001),同時(shí)DNMT3b的mRNA過(guò)表達(dá)顯著與多基因的高度甲基化顯著相關(guān)(P=0.021)。當(dāng)同時(shí)考慮DNMT1和DNMT3b過(guò)表達(dá)時(shí),這種顯著相關(guān)性更強(qiáng)(P=0.008),并且與腫瘤早期階段(pT1-2)顯著相關(guān)(P=0.01)。相對(duì)正常對(duì)照

5、健康人,在食管鱗癌患者血清游離DNA中同樣也發(fā)生了異常的高甲基化水平(CDH1為84.4％和20％,DAPK為73.3％和13.3％,RASSF1A為62.2％和6.7％,RAR-β為26.7％和13.3％,p16為6.7％和0％)。當(dāng)2個(gè)及更多的高甲基化基因進(jìn)行聯(lián)合分析時(shí),這種甲基化腫瘤標(biāo)志物的靈敏度和特異性明顯提高,具有較好的潛在診斷價(jià)值(RDC AUC0.911,82.2％的靈敏度和100％的特異性)。
　　 結(jié)論:

6、>　　 多個(gè)腫瘤相關(guān)基因的高甲基化可能參與了食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展,并且這種異常甲基化調(diào)控可能受上調(diào)表達(dá)的DNMT3b所介導(dǎo)。另外,食管鱗癌患者血清DNA中多個(gè)腫瘤相關(guān)基因的甲基化將可能作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物用于食管鱗癌的篩查和早期診斷。
　　 第二部分分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族基因(SFRPs)甲基化與食管鱗癌相關(guān)性研究
　　 背景:
　　 分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族(SFRPs)包括五種分泌型糖蛋白,并作為一類拮抗

7、物參與Wnt信號(hào)調(diào)節(jié)。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的異常激活是人類多種腫瘤的一個(gè)重要特征。因此Wnt通路負(fù)調(diào)節(jié)物SFRPs蛋白的異常改變可能參與了腫瘤的發(fā)生。在多種腫瘤中SFRPs基因的異常甲基化和表達(dá)沉默常發(fā)生,但在食管鱗癌中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 方法:
　　 本文通過(guò)甲基化特異性PCR分析了47例食管鱗癌患者癌與癌旁正常組織中SFRP家族基因4個(gè)成員(SFRP1,2,4和5)的啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),同時(shí)通過(guò)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PC

8、R評(píng)價(jià)了它們的mRNA表達(dá)水平。其次,實(shí)驗(yàn)通過(guò)甲基化特異性PCR和熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5-雜氮-2-脫氧胞苷)和組蛋白去乙酰化抑制劑(曲古菌素A)處理和未處理的食管鱗癌細(xì)胞系中SFRPs基因的甲基化狀態(tài)和mRNA表達(dá)水平。通過(guò)亞硫酸鹽基因組測(cè)序分析了SFRP1和SFRP5啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平。最后,實(shí)驗(yàn)分析了食管鱗癌組織中SFRPs甲基化與DNMTs上調(diào)表達(dá)的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 47

9、例食管鱗癌患者腫瘤組織中SFRP1,SFRP2,SFRP4和SFRP5甲基化頻率依次為51.1％,61.7％,46.8％和44.7％,而在對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中的甲基化頻率依次為23.4％,55.3％,34.096和25.5％,僅SFRP1的高甲基化頻率在兩組中存在顯著差異(P=0.01)。SFRP1的甲基化頻率在小于5cm的腫瘤組織中顯著更高(P<0.0001)。相對(duì)于癌旁正常組織,四個(gè)SFRPs基因中只有SFRP1在腫瘤組織中mRNA表

10、達(dá)顯著下調(diào)(P=0.026)。食管鱗癌細(xì)胞系經(jīng)去甲基化藥物和去乙酰化抑制劑聯(lián)合處理后,沉默表達(dá)的SFRP1基因又重新恢復(fù)了表達(dá)。亞硫酸鹽基因組測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)了在食管鱗癌組織和細(xì)胞系中SFRP1啟動(dòng)子區(qū)存在密集的甲基化位點(diǎn)。本研究并未發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組中SFRPs的異常甲基化與DNMTs的mRNA表達(dá)上調(diào)顯著相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 SFRPs基因的高甲基化是食管鱗癌中一個(gè)常見(jiàn)的早期分子異常改變。在SFRPs家族基因中,SF

11、RP1基因是食管鱗癌發(fā)生中一個(gè)主要的高頻率表觀失活靶點(diǎn)。異常的啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致SFRP1基因表達(dá)的功能性沉默。研究結(jié)果也提示SFRP1基因的甲基化沉默也許是食管鱗癌中Wnt信號(hào)通路異常激活的重要機(jī)制之一,并且可能作為食管鱗癌的一個(gè)標(biāo)志物用于臨床的診治。
　　 第三部分食管鱗癌全基因組等位基因表達(dá)譜研究
　　 背景:
　　 等位基因特異表達(dá)(ASE)是表型差異的重要機(jī)制之一,并且這種現(xiàn)象存在于腫瘤細(xì)胞中。盡管X染色

12、體失活和基因組印記這些染色體等位基因特異表達(dá)典型例子的生物學(xué)功能已經(jīng)被熟知,但在人類食管鱗癌中全基因組的等位基因表達(dá)譜分析還沒(méi)有被研究。
　　 方法:
　　 本文結(jié)合了高通量芯片分析和高效RNA混合池策略的SNP—MaP(SNP Microarraysand Pooling)方法,利用Affymetrix Genome-wide Human SNP Array6.0對(duì)9例食管鱗癌與癌旁對(duì)照正常組織標(biāo)本進(jìn)行了全基因等位基因

13、表達(dá)分析。通過(guò)基因群富集分析對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了功能分類。同時(shí)通過(guò)甲基化特異性PCR對(duì)一些表達(dá)顯著差異的基因進(jìn)行了甲基化分析,并比較其ASE差異與甲基化的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 相對(duì)癌旁正常組織,食管鱗癌組織中基因組整體表達(dá)模式呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)。其中1526個(gè)基因發(fā)生了顯著表達(dá)下調(diào),463個(gè)基因則顯著表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。在下調(diào)的基因中,47.2％(721/1526)的基因存在顯著ASE差異。表達(dá)下調(diào)基因主要分布在

14、腺嘌呤核苷酸和鈣離子結(jié)合基因、分子信號(hào)傳導(dǎo)膜受體活性基因、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜桂關(guān)基因和神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知與感應(yīng)過(guò)程相關(guān)基因四類功能基因中。一些表達(dá)下調(diào)基因(APC,MGMT,PAR-β,CDKN2A和SFRP4)在腫瘤組織中都存在不同程度的甲基化(范圍:11.1％-66.7％),同時(shí)這些基因存在顯著ASE差異或強(qiáng)的趨勢(shì)。
　　 結(jié)論:
　　 本研究證實(shí)Affymetrix Human SNP芯片和高效混合池策略結(jié)合的SNP—MaP能銹