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文檔簡介
1、本論文以DO-Stat法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡動態(tài)模式識別控制法(ArtificialNeuralNetworkPatternRecognitionbasedcontrol,ANNPR-Ctrl)為手段,對畢赤酵母流加培養(yǎng)生產(chǎn)融合蛋白HSA-IL-2過程中的甘油流加控制策略和性能指標進行了比較研究。在細胞生長期采用基于DO(溶解氧)/pH在線測量的ANNPR-Ctrl法特別有效。它可以有效地增加細胞的生產(chǎn)強度,縮短培養(yǎng)時間,使以甲醇為誘導劑的融
2、合蛋白的誘導開始時間大幅提前。但是,在誘導期,甲醇濃度必須控制在一定水平才能實現(xiàn)融合蛋白的有效表達。同時,重組畢赤酵母菌(KM71,Muts)利用甲醇能力弱,無法利用DO和pH判斷甲醇的過量或匱乏的狀況。因此,在誘導期使用甲醇在線電極來控制甲醇流加,可以將甲醇濃度控制在設定范圍之內(nèi),實現(xiàn)融合蛋白的有效表達。 利用重組畢赤酵母菌(KM71,Muts)表達生產(chǎn)人白蛋白修飾的白介素-2(HSA-IL-2)過程中,DO和甲醇濃度是影響目
3、標蛋白表達的關鍵因素。實驗發(fā)現(xiàn)HSA-IL-2生產(chǎn)菌對DO的需求不是很高,通過使用空氣并結(jié)合調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速就能滿足其對DO的需求。誘導3天后,在正常DO、較低甲醇濃度下(DO20-60%,甲醇濃度5-8g/L),HSA-IL-2表達量為23mg/L,為搖瓶表達量的2.5倍;在高DO、低甲醇濃度(DO80%-120%,甲醇濃度2-5g/L)下,HSA-IL-2表達量可進一步提高18%,達到27mg/L;DO振蕩、低甲醇濃度(甲醇濃度2-7g
4、/L)條件不利于HSA-IL-2的表達;在正常DO、較高甲醇濃度下(DO20-60%,甲醇濃度1.5-23g/L),HSA-IL-2表達量最高,達到44.6mg/L。誘導前期,甲醇濃度過高易導致菌體中毒,不利于HSA-IL-2的表達。此外,在誘導階段,通過限制性添加甘油可以有效提高菌體的呼吸活性,促進菌體生長,并且緩解甲醇對菌體的毒性。 本文還對重組畢赤酵母菌(GS115,Mut+)表達融合蛋白HSA-CP進行了初步研究。實驗發(fā)
5、現(xiàn)該菌對DO的需求很高。通富氧空氣(50%,V/V)時最高菌體濃度OD600可達到600,約為通空氣時相應值的1.8倍。與HSA-IL-2生產(chǎn)菌相比,該菌的誘導特性也不同。它利用甲醇能力強、誘導時間短,在5L發(fā)酵罐誘導15h內(nèi),HSA-CP蛋白表達量就可以達到最大值,而相應的搖瓶水平的最大蛋白表達量要在誘導3天才能達到。使用空氣時HSA-CP最高表達量為108mg/L,略低于搖瓶;而通富氧空氣時HSA-CP最高表達量可提高一倍,達到23
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