畢赤酵母高效表達融合蛋白的環(huán)境和控制條件研究.pdf

1、本論文以DO-Stat法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡動態(tài)模式識別控制法(ArtificialNeuralNetworkPatternRecognitionbasedcontrol，ANNPR-Ctrl)為手段，對畢赤酵母流加培養(yǎng)生產(chǎn)融合蛋白HSA-IL-2過程中的甘油流加控制策略和性能指標進行了比較研究。在細胞生長期采用基于DO(溶解氧)/pH在線測量的ANNPR-Ctrl法特別有效。它可以有效地增加細胞的生產(chǎn)強度，縮短培養(yǎng)時間，使以甲醇為誘導劑的融

2、合蛋白的誘導開始時間大幅提前。但是，在誘導期，甲醇濃度必須控制在一定水平才能實現(xiàn)融合蛋白的有效表達。同時，重組畢赤酵母菌(KM71，Muts)利用甲醇能力弱，無法利用DO和pH判斷甲醇的過量或匱乏的狀況。因此，在誘導期使用甲醇在線電極來控制甲醇流加，可以將甲醇濃度控制在設定范圍之內(nèi)，實現(xiàn)融合蛋白的有效表達。 利用重組畢赤酵母菌(KM71，Muts)表達生產(chǎn)人白蛋白修飾的白介素-2(HSA-IL-2)過程中，DO和甲醇濃度是影響目

3、標蛋白表達的關鍵因素。實驗發(fā)現(xiàn)HSA-IL-2生產(chǎn)菌對DO的需求不是很高，通過使用空氣并結(jié)合調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速就能滿足其對DO的需求。誘導3天后，在正常DO、較低甲醇濃度下(DO20-60％，甲醇濃度5-8g/L)，HSA-IL-2表達量為23mg/L，為搖瓶表達量的2.5倍；在高DO、低甲醇濃度(DO80％-120％，甲醇濃度2-5g/L)下，HSA-IL-2表達量可進一步提高18％，達到27mg/L；DO振蕩、低甲醇濃度(甲醇濃度2-7g

4、/L)條件不利于HSA-IL-2的表達；在正常DO、較高甲醇濃度下(DO20-60％，甲醇濃度1.5-23g/L)，HSA-IL-2表達量最高，達到44.6mg/L。誘導前期，甲醇濃度過高易導致菌體中毒，不利于HSA-IL-2的表達。此外，在誘導階段，通過限制性添加甘油可以有效提高菌體的呼吸活性，促進菌體生長，并且緩解甲醇對菌體的毒性。 本文還對重組畢赤酵母菌(GS115，Mut+)表達融合蛋白HSA-CP進行了初步研究。實驗發(fā)

5、現(xiàn)該菌對DO的需求很高。通富氧空氣(50％，V/V)時最高菌體濃度OD600可達到600，約為通空氣時相應值的1.8倍。與HSA-IL-2生產(chǎn)菌相比，該菌的誘導特性也不同。它利用甲醇能力強、誘導時間短，在5L發(fā)酵罐誘導15h內(nèi)，HSA-CP蛋白表達量就可以達到最大值，而相應的搖瓶水平的最大蛋白表達量要在誘導3天才能達到。使用空氣時HSA-CP最高表達量為108mg/L，略低于搖瓶；而通富氧空氣時HSA-CP最高表達量可提高一倍，達到23