人乳酸脫氫酶C4基因突變的檢測及其在男性不育發(fā)病中的作用.pdf

1、乳酸脫氫酶C4（lactate dehydrogenase-C4，LDH-C4）為LDH蛋白家族中一個特殊的同工酶，僅在哺乳動物成熟的睪丸（testis）和精子（spermatozoa）中表達，在精子的能量代謝中發(fā)揮重要作用，是精子運動、獲能及受精等過程的一個關(guān)鍵酶，其功能或活性異常與男性不育有密切關(guān)系。
　　本研究優(yōu)化了以2-羥基戊酸為LDH-C4底物檢測精子LDH-C4活性的染色方法，建立了該方法酶活性積分的正常參考范圍，繪制

2、了ROC曲線，并初步得到該方法診斷的靈敏度為89.5％，特異性為91.2%。同時，開發(fā)了一種以2-羥基丁酸鈉為底物的LDH-C4活性顯色方法。在此基礎(chǔ)上，對一組精子LDH-C4活性降低的特發(fā)性不育患者進行Ldhc基因突變檢測，并通過T克隆加以確證。結(jié)果顯示，一名患者編碼區(qū)第5外顯子的40位堿基產(chǎn)生T→G雜合突變，對應(yīng)Ldhc基因的第153位密碼子由TTA變?yōu)門GA，將其命名為L153X突變。為研究L153X突變引起男性不育的致病機制，采

3、用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建了野生型 Ldhc的原核、真核重組載體，并利用人工誘導突變技術(shù)獲得了L153X突變體的重組質(zhì)粒，通過誘導表達和轉(zhuǎn)染HeLa細胞，模擬L153X純合、雜合突變對LDH-C4活性的影響，研究野生型和突變型C亞基間的相互作用。結(jié)果提示，純合和雜合突變可導致LDH-C4活性的喪失或降低，且野生型和突變型 C亞基間可能存在相互作用。本研究同時利用在線生物信息學軟件，建立了L153X突變體的空間結(jié)構(gòu)模型，并對其生物學功能進行初步

4、預測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L153X喪失了153～332位之間的氨基酸殘基以及多個酶活性位點和底物結(jié)合位點，不能自發(fā)同源聚合形成具有催化活性的四聚體。通過精子能量代謝測定、計算機輔助精液分析（CASA）及精子獲能試驗，研究L153X突變對精子能量代謝、運動及功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L153X突變的精子存在能量代謝異常和獲能障礙。證明了Ldhc基因突變可導致男性不育的假說，并從分子遺傳角度為男性不育提供了新的病因?qū)W解釋。此外，開發(fā)的2-羥基丁酸鈉底物法測