草魚恒定鏈基因的克隆、分子特征及其與MHC分子關系的研究.pdf

1、恒定鏈（invariant chain，Ii）是一種非多態(tài)性II型跨膜糖蛋白，編碼的白細胞分化抗原為CD74，存在于多種細胞表面上。Ii鏈是MHC II類分子的重要伴侶蛋白，在內質網(wǎng)中輔助MHC II類分子進行正確的折疊、組裝并與MHC II類分子聚合成(αβIi)3九聚體以及靶向內體的轉運，同時Ii鏈以其CLIP區(qū)(the class-IIassociated Ii chain peptide)占據(jù)MHC II類分子的抗原結合槽，從而

2、阻止內源性抗原肽與MHC II類分子結合。 Ii鏈在MHC II類分子呈遞外源性抗原給CD4+T淋巴細胞的過程中起著關鍵性作用，對于機體的免疫應答具有重要調節(jié)意義。目前基于Ii的核酸疫苗已得到相關應用。
　　前，對于Ii鏈結構與功能的研究主要集中在人等哺乳動物以及禽類，而對魚類了解甚少。魚類處于生物鏈的底端。為研究魚類Ii鏈的結構與功能，本實驗首次獲得了草魚Ii鏈的基因序列，并對其生物信息學分析和結構建模，同時對草魚Ii與MHC在

3、不同組織中的定量表達關系和細胞定位表達進行了研究，最后制備了草魚恒定鏈的特異性抗體，為進一步研究魚恒定鏈的結構功能、進化關系以及與主要組織相容性復合體的關系提供理論基礎。
　　第一，本實驗應用RT-PCR和RACE法成功克隆了草魚魚Ii基因，經(jīng)測序和比對鑒定該草魚Ii的全長大小為1116bp，編碼區(qū)的大小是711bp，含有236個氨基酸。
　　第二，利用生物信息學方法將草魚Ii鏈與其他物種的Ii鏈進行比對，發(fā)現(xiàn)草魚Ii鏈也包

4、括胞漿區(qū)、跨膜區(qū)、內質網(wǎng)腔區(qū)和甲狀蛋白（Tg）4個結構域。根據(jù)推測的氨基酸序列，進行不同種間Ii鏈的同源性進化關系分析，發(fā)現(xiàn)草魚與鰱魚的親緣關系最近。應用生物學相關軟件，將草魚Ii鏈與其他物種比較，構建3D結構模型，結果發(fā)現(xiàn)草魚與人、小鼠、雞、鵝和斑馬魚的Ii鏈在空間結構上十分相似，甚至在一些位點上的氨基酸都是相同的。
　　第三，以18sRNA基因為內參基因，運用相對熒光定量的方法檢測Ii與MHC在草魚十二種不同組織中的表達關系，

5、結果表明草魚Ii與MHC在組織中的表達呈正相關，同時還將Ii與MHC分別插入真核表達質粒Pmcherry-C1和pEGFP-N1，轉染293T細胞，結果顯示它們分別定位于內膜系統(tǒng)。
　　最后，原核表達草魚Ii，以純化的蛋白免疫小鼠制備了抗草魚Ii的多克隆抗體，并通過Western Blot驗證了抗體的特異性，為研究Ii與MHC的相互作用提供一定基礎。
　　上述實驗表明，作為重要免疫分子的Ii鏈，不僅在遺傳背景上而且在空間的結