草魚重復(fù)基因IGF-2的克隆及其功能研究.pdf

1、草魚(Ctenopharyngodon idellus)是我國重要的經(jīng)濟(jì)魚類，養(yǎng)殖產(chǎn)量在淡水魚類中名列前茅。草魚個體較大，性成熟周期長，采用傳統(tǒng)方法很難在短期內(nèi)培育出優(yōu)良品種。草魚基因組中存在著大量的未知功能主效基因、非編碼RNA和DNA調(diào)控元件。解讀這些組分的功能對于認(rèn)識草魚生殖、生長、發(fā)育及抗逆等性狀具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。
　　 IGF-2是胰島素樣生長因子家族的重要成員，它受到生長激素的調(diào)控，能促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂和

2、分化，與魚類胚胎發(fā)育和成體生長緊密相關(guān)。在哺乳動物僅中存在一個IGF-2基因，而斑馬魚中卻存在兩個重復(fù)的IGF-2基因，即igf-2a和igf-2b，且研究表明斑馬魚igf-2a和igf-2b出現(xiàn)了明顯的功能分化。由于在其他硬骨魚類中尚未發(fā)現(xiàn)存在igf-2b基因的報道，因此不能確定重復(fù)IGF-2基因是否與魚類特有的第3次全基因組重復(fù)相關(guān)：此外，重復(fù)IGF-2基因的促生長功能差異也有待探討。
　　 本文通過RACE方法，首次獲得了

3、養(yǎng)殖魚類草魚IGF-2a/b重復(fù)基因cDNA的全長序列，IGF-2a和IGF-2b基因全長分別為2076bp和1692bp，開放閱讀框分別為603bp和692bp，編碼201和212個氨基酸殘基。這為草魚和斑馬魚中的IGF-2a和IGF-2b基因是由魚類特有的第三次全基因組復(fù)制所產(chǎn)生的提供了新的依據(jù)。與人IGF一樣，草魚IGF-2a和IGF,2b成熟肽均由B、C、A、D四個結(jié)構(gòu)域組成，其中所有6個半光氨酸完全保守。不同胚胎時期RT-PC

4、R分析結(jié)果表明，草魚IGF-2a和IGF-2b基因在整個胚胎發(fā)育過程中都有表達(dá)，且表達(dá)量均比較恒定，表達(dá)量差異不明顯。整胚原位雜交結(jié)果顯示，IGF-2b mRNA在草魚胚胎中存在廣泛表達(dá)，而IGF-2a則僅在脊索和腦中表達(dá)。在成年草魚中，IGF-2b在除鰓之外的所有組織中表達(dá)，而IGF-2a則主要在肝臟中表達(dá)。這表明草魚IGF-2b可能保留了IGF-2的原始功能，在成年草魚的代謝過程中行使1GF-2的主要功能。而IGF-2a則在進(jìn)化過程

5、中發(fā)生了亞功能化，并失去了祖基因的大部分功能。生長激素可誘導(dǎo)草魚肝細(xì)胞中的IGF-2a和-2b轉(zhuǎn)錄本水平快速上調(diào)。此外，營養(yǎng)水平也會影響草魚IGF-2a和IGF-2b的轉(zhuǎn)錄水平，肝臟中IGF-2a和IGF-2b mRNAs的表達(dá)量在2到6天的饑餓過程中明顯下降，在恢復(fù)喂食后迅速回復(fù)。通過構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-KG-IGF-2進(jìn)行了IGF-2a的原核表達(dá)研究，確定IGF-2a蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為30℃0.1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3