枯否細(xì)胞分離培養(yǎng)及其在同種肝移植免疫中作用機(jī)制初步探討.pdf

1、第一部分:大鼠及人肝臟枯否細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)
　　目的:
　　改進(jìn)大鼠肝枯否細(xì)胞(kupffer cell,KC)分離、純化和培養(yǎng)技術(shù),探討從人體肝臟手術(shù)標(biāo)本中分離、純化和培養(yǎng)枯否細(xì)胞的可行有效方法,以便進(jìn)一步研究人體枯否細(xì)胞的生物學(xué)功能。
　　方法:
　　24只SD大鼠肝臟及6例人體肝臟手術(shù)標(biāo)本用于本實(shí)驗(yàn)。大鼠肝臟通過門靜脈、人體肝組織通過肝靜脈灌注預(yù)灌流液,灌注后肝臟標(biāo)本采用離體膠原酶灌注消化獲得細(xì)胞懸液,

2、然后通過差速離心去除細(xì)胞懸液中的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞,獲得富含KC的肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。改傳統(tǒng)PBS重懸肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞為25％percoll重懸,從而形成新percoll梯度為:PBS、含肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的25%percoll、50% percoll,然后通過不連續(xù)密度梯度離心分離獲得枯否細(xì)胞,最后選擇性貼壁進(jìn)一步純化。應(yīng)用吞噬功能實(shí)驗(yàn)對KC進(jìn)行鑒定,臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)判定細(xì)胞活力。
　　結(jié)果:
　　最終獲得的枯否細(xì)胞的產(chǎn)量分別為:大鼠3.1±0.5

3、×106/g肝臟,人體肝臟組織為2.3±0.4×106/g肝臟,細(xì)胞活力和純度均達(dá)90%。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)建立的大鼠及人體肝臟枯否細(xì)胞分離方法,簡便經(jīng)濟(jì),效果穩(wěn)定,獲得的枯否細(xì)胞可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。
　　第二部分:人枯否細(xì)胞在同種肝移植免疫中作用機(jī)制初步探討目的:
　　通過將枯否細(xì)胞和/或同種異體混合淋巴細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng),觀察共培養(yǎng)細(xì)胞KC和PBMC表面HLA-G蛋白表達(dá),測定培養(yǎng)上清液中一氧化氮和

4、細(xì)胞因子的變化,觀察KC對淋巴細(xì)胞增殖的影響,探討枯否細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中的作用及機(jī)制,試圖了解枯否細(xì)胞在肝移植免疫耐受中的功能作用,為進(jìn)一步利用枯否細(xì)胞特異性誘導(dǎo)肝移植耐受的實(shí)驗(yàn)與臨床研究提供依據(jù)。
　　方法:
　　分離健康志愿者及接受肝臟手術(shù)者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC,分別記為Pr及Pd),各6例。將枯否細(xì)胞和/或異體混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)組,包

5、括:PP組,即Pr+Pd;KP組,即Kc+Pr;KPP組,即Kc+Pr+Pd,將單獨(dú)Pr,Pd,Kc及Kc+Pd培養(yǎng)組作為對照組。其中24孔板培養(yǎng)組用于收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液,96孔板培養(yǎng)組用于 MTT實(shí)驗(yàn)。分別于培養(yǎng)后第1、2、4、6天收集細(xì)胞上清液,置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?天培養(yǎng)結(jié)束時(shí)分別收獲培養(yǎng)的枯否細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞。應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測HLA-G在枯否細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞表面的表達(dá);應(yīng)用硝酸還原酶法測定上清液中NO的濃

6、度,用雙抗體夾心 ABC-ELISA技術(shù)測定上清液中干擾素-γ、白介素-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β1的濃度;用MTT法測定PP組及KPP組中淋巴細(xì)胞增殖。
　　應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x± S)表示,組間比較采用單向方差分析法(One-way ANOVA),組間兩兩比較采用SNK(Student-Newman-keuls)-q檢驗(yàn),以p<0.05為具有顯著性差異統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)

7、果:
　　1、在培養(yǎng)第6天,實(shí)驗(yàn)組及對照組中枯否細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞表面均未檢測到HLA-G的表達(dá)。
　　2、含枯否細(xì)胞的混合培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中,NO的產(chǎn)量顯著上升,且在任一相同時(shí)間點(diǎn),KPP組顯著高于KP組(P<0.01),并且均在第4天達(dá)峰值, PP組也呈相同變化趨勢,但均低于同時(shí)點(diǎn)的KPP組、KP組產(chǎn)量(P<0.01),對照組中僅 Kc,Kc+Pd組檢測到 NO的少量分泌。在第1、2天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),KPP組中IFN

8、-γ的含量高于PP組而在隨后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),PP組中IFN-γ值均高于同時(shí)點(diǎn)的KPP組和KP組,該三組中IFN-γ的變化趨勢相似,均在第4天達(dá)最高值,隨后下降。對照組中未能檢測到IFN-γ的表達(dá)。PP實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清夜中第1天未能檢測到IL-10,在以后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分泌呈持續(xù)上升趨勢,在第6天時(shí)達(dá)7.714±2.651pg/ml,而在KPP組和KP組中,IL-10呈相對強(qiáng)勢分泌,KP組顯著高于KPP組(P<0.01),在第4天達(dá)峰值隨后降低

9、,但KPP組仍呈上升趨勢。對照組中未能檢測到IL-10的表達(dá)。在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中,轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的含量呈持續(xù)上升趨勢,至第6天時(shí)仍在升高,且在任一同時(shí)間點(diǎn),KP組中TGF-β1的含量均高于KPP組及PP組(P<0.01),且PP組與KPP組比較,差異也有顯著性,PP組在第1天時(shí)未能檢測到TGF-β1。對照組中僅Kc,Kc+Pd組檢測到TGF-β1的少量分泌。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),KPP組中OD值顯著低于PP組(P<0.05)。