佛波酯對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響.pdf

1、12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)是佛波酯類化合物中活性較高的一種,具有誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞分化的作用。TPA在誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞分化的同時對細(xì)胞功能方面的影響尚未見報道,如粘附能力、遷移運(yùn)動、侵襲能力等。
　　 目的：
　　 主要觀察TPA對人肺腺癌A549細(xì)胞在遷移運(yùn)動能力、侵襲能力和對順鉑敏感性等方面的影響。
　　 方法：

2、>　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)所用細(xì)胞均在環(huán)境條件為37℃±0.3℃、相對濕度≥95％、CO2濃度5％±0.1％的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞為A549細(xì)胞、A549／TPA細(xì)胞、A549／R-CDDP細(xì)胞。A549／TPA細(xì)胞:A549細(xì)胞用含5ng／ml TPA、10％胎牛血清的RPMI1640傳代培養(yǎng),9個月后篩選出的能夠在含5ng／ml TPA的培養(yǎng)基中穩(wěn)定貼壁生長的細(xì)胞。然后用含5ng

3、／ml TPA的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng),用于實(shí)驗(yàn)。A549／R-CDDP細(xì)胞:A549細(xì)胞用含不同濃度順鉑、10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)10個月后,篩選出能夠在含2μg／ml順鉑的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長的細(xì)胞,耐藥倍數(shù)達(dá)10倍以上,可以認(rèn)為是耐順鉑的A549細(xì)胞。然后用含2μg／ml順鉑的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng),用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2、實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用MTT比色法、人工細(xì)胞計(jì)數(shù)法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察TPA對細(xì)胞增殖特性和細(xì)胞形態(tài)的影響。用流式細(xì)胞

4、儀并結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)的方法,判斷TPA對細(xì)胞周期的影響。用MTT比色法測定TPA聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞的敏感性。用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法測定細(xì)胞對人工基底膜的粘附能力、運(yùn)動能力,對Transwell侵襲小室的侵襲能力,用流式細(xì)胞儀測定趨化因子受體(CXCR4)表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、TPA對細(xì)胞增殖特性的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,A549細(xì)胞用TPA1ng／ml、5ng／ml處理組的抑制率與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,

5、TPA10ng／ml處理組與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TPA對A549細(xì)胞時間依賴關(guān)系分析,TPA5ng／ml處理組從第3天開始出現(xiàn)有大量的懸浮細(xì)胞,而對照組無此現(xiàn)象；A549／TPA細(xì)胞的TPA5ng／ml處理組從第4天開始與對照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且失去對數(shù)生長的特性,單位面積的細(xì)胞密度降低,7天后A549／TPA細(xì)胞密度是對照組的27.31％。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示A549細(xì)胞用TPA1ng／ml、5ng／ml處理組存活分?jǐn)?shù)與對照

6、組相比分別降低44.20％、72.10％,A549／TPA細(xì)胞的TPA5ng／ml處理組的存活分?jǐn)?shù)與對照組相比降低52.30％。
　　 2、TPA對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中,A549細(xì)胞的TPA1ng／ml、5ng／ml處理組和A549／TPA細(xì)胞組都存在細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡或類似網(wǎng)球拍狀的空泡細(xì)胞現(xiàn)象,而對照組無此現(xiàn)象。A549細(xì)胞的TPA1ng／ml、5ng／ml處理組的空泡細(xì)胞所占整個克隆集落的比例分別為8.41％、2

7、6.38％。
　　 3、TPA對細(xì)胞周期G0期和G1期的影響結(jié)果顯示,TPA促進(jìn)A549細(xì)胞的G0期細(xì)胞進(jìn)入G1期并把A549細(xì)胞阻滯在G1期,A549／TPA細(xì)胞的這種結(jié)果更顯著。
　　 4 TPA增強(qiáng)細(xì)胞對順鉑敏感性 A549細(xì)胞,單用順鉑時IC50為0.46μg／ml,聯(lián)合TPA時順鉑的IC50為0.16μg／ml；A549／TPA細(xì)胞,聯(lián)合TPA時順鉑的IC50為0.08μg／ml。A549／R-CDDP細(xì)胞,單

8、用順鉑時IC50為6.98μg／ml,TPA處理三天后聯(lián)合TPA時順鉑的IC50為3.02μg／ml。實(shí)驗(yàn)各組所使用的TPA濃度為5ng／ml,在此濃度下單用TPA的抑制率與各自對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 5、TPA對細(xì)胞的粘附、運(yùn)動、侵襲能力和趨化因子受體(CXCR4)表達(dá)的影響
　　 5.1對人工基底膜粘附能力的影響TPA處理組與對照組相比粘附能力降低73.91％o
　　 5.2對細(xì)胞在人工基底膜上運(yùn)動能

9、力的影響在人工基底膜上培養(yǎng)細(xì)胞后,對照組出現(xiàn)相互交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的“晶格”形態(tài),細(xì)胞鏈接、纏繞在一起形成的“管道”,而TPA處理組的細(xì)胞單個散在分布不能形成“晶格”和“管道”狀形態(tài)。
　　 5.3對侵襲能力的影響 TPA處理組與對照組相比侵襲能力降低52.27％。
　　 5.4對趨化因子受體(CXCR4)表達(dá)的影響 TPA處理 A549細(xì)胞24h后,CXCR4的陽性表達(dá)率和熒光強(qiáng)度與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TPA處理5d后