臍血干細胞移植重建免疫功能抑制人肝癌的實驗研究.pdf

1、近十余年來，造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)的適應證在逐漸擴展，干細胞來源也在不斷增加。臍血移植(umbilical cord blood transplantation，LICBT)就是利用臍帶血中造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSC)重建造血免疫系統(tǒng)的一種HSCT療法。UCBT應用于臨床是對以往廢棄的物質(zhì)有效的利用，也開辟了HSC

2、的另一來源。當前，HSCT臨床取得治療實效的疾病除十余種血液病外，還包括免疫缺陷病、遺傳性疾病、實體瘤等近20余種疾病。原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤之一，惡性度高，預后差，且發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重危害著人類健康。我國每年約23萬人死于肝癌，占全球肝癌患者死亡數(shù)的53％。其治療除了手術切除、介入導向、射頻、化療、放療外，免疫治療及其相關研究已日益受到重視。國內(nèi)外對肝癌的研究已使人認

3、識到，肝癌的生長、轉(zhuǎn)移與復發(fā)除了與肝癌細胞自身的生物學特性有關外，也與機體對肝腫瘤的免疫狀態(tài)密切相關。而目前關于腫瘤與免疫研究的主要困難之一是缺乏有效實用的動物模型。嚴重聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficient,SCID)小鼠是細胞免疫、體液免疫均缺陷的突變系鼠，是臍血移植及肝癌與免疫研究較為理想的實驗動物。 為進一步探討UCBT后免疫功能情況以及新建免疫對肝癌的影響，我們設計并進行了本項研究

4、。研究分兩部分：第一部分以人臍血造血干／祖細胞移植入SCID小鼠體內(nèi)建立人鼠嵌合模型，觀察臍血的移植潛能及重建免疫特征，并為下一步實驗打下基礎。第二部分在SCID鼠體內(nèi)建立的類似人體免疫系統(tǒng)環(huán)境內(nèi)，接種人肝癌細胞株，探討免疫細胞對肝癌移植瘤生長的影響，并研究其在肝癌負荷狀態(tài)下的免疫功能變化情況。為臨床合理有效地利用臍血干細胞對肝癌進行免疫治療提供依據(jù)。 第一部分嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠臍血移植后的免疫功能重建 目的：初步觀察

5、人臍血干／祖細胞在SCID鼠體內(nèi)的生長特性，免疫功能重建的時間與狀態(tài)。 方法：采集足月健康胎兒新鮮臍血，以6％HES+NH<,4>CL破紅細胞液法分離人臍帶血有核細胞，檢測有核細胞回收率及CD34<'+>細胞含量，立即使用或凍存?zhèn)溆谩CID鼠21只，按隨機原則分為A、B、C三組，每組各7只。A組：臍血移植免疫功能重建、無腫瘤組；B組：臍血移植免疫功能重建、荷瘤組；C組：未重建免疫功能(免疫缺陷)、荷瘤組。A、B組分別經(jīng)尾靜脈程

6、序移植(分5次)，注入人臍血有核細胞(總量5×10<'7>)，兩組小鼠移植前都給予低劑量的環(huán)磷酰胺(150mg／kg)，并連續(xù)使用甲基強的松龍一周(自20mg／kg逐漸減量至5mg／kg)作為預處理。C組為未移植對照組。觀察各組小鼠存活情況，3周后A、B組每周斷尾或經(jīng)尾靜脈取血應用流式細胞儀(Flow cytometry,FCM)及酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA法)檢測免疫功能重建情況，C組第三周、第六周各檢測一次免疫功能作為對照。

7、 結果:1．采用6％HES+NH<,4>CL，破紅細胞液分離法，有核細胞分離率81.6％，CD34<'+>細胞回收率70.9％，細菌培養(yǎng)(一)。 2．六周內(nèi)，臍血程序移植小鼠A組無死亡，B組于第一次移植后第12天死亡一只，尸檢無明顯GVHD征象。對照組C組于第26天死亡1只，死因不祥。三組死亡率比較P值均大于0.05，無統(tǒng)計學差異。 3．A、B組小鼠外周血于第四周時開始檢測到人源CD3<'+>細胞，至第六周時分別為A

8、組CD3<'+>(1.60±O.32)％，CD4<'+>／CD8<'+>2.36±0.74；B組CD3<'+>(1.56±0.30)％，CD4<'+>／CD8<'+>2.83±2.15。兩組比較P<,CD3>=0.842、P<,CD4／CD8>=0.654，均無統(tǒng)計學差異。小鼠血清中人源IgG于第三周時出現(xiàn)，至第六周時分別為A組(50.13±1.27)μg/ml， B組(48.12±3.89)μg/ml。兩組比較P=0.273，無統(tǒng)計

9、學差異。C組第三周、第六周時均未檢測到人源CD3<'+>細胞、人源IgG，與A組、B組比較P值均小于0.01，有顯著差異。 結論：6％HES+NH<,4>CL破紅細胞液分離法是一種成熟有效的分離方法，有核細胞分離率及CD34<'+>細胞回收率均較高，且終體積小，污染機會少，可在動物實驗研究中推廣應用。人臍血程序移植加低劑量的環(huán)磷酰胺方案可替代照射預處理成功地在SCID鼠體內(nèi)建立類似人類免疫。 目的 證實臍血造血干／粗細胞

10、移植重建SCID鼠免疫對人肝癌有抑制及殺傷作用并探討其免疫學機制是否為負荷人腫瘤激活人源性免疫功能。 方法 首先進行人肝癌高轉(zhuǎn)移細胞株HCCLM<,6>細胞培養(yǎng)，然后以HCCLM<,6>細胞株分別在臍血移植免疫功能重建組(B組)及未移植臍血造血干／祖細胞組(C組)建立SCID鼠皮下荷瘤模型，臍血移植免疫功能重建A組作為對照組。實驗動物于接種腫瘤后5周處死，分別進行以下檢測：1．比較B、C兩組之間腫瘤生長情況的差異。2．比較B、

11、A兩組之間免疫功能指標變化情況，即用流式細胞儀分析小鼠外周血有核細胞中人淋巴細胞比例，ELISA法測定人IgG含量。3．比較A組第6周與第11周時免疫功能指標變化情況。4．常規(guī)病理學檢查：比較B、C兩組移植瘤狀況，并觀察有無腫瘤轉(zhuǎn)移。5．免疫組化檢查：觀察B組腫瘤組織中人源CD3<'+>、CD8<'+>細胞對腫瘤組織的殺傷。5．細胞毒試驗：B、C兩組動物脾臟細胞與HCCLM6細胞體外混合培養(yǎng)，采用MTT法觀察對腫瘤細胞的殺傷作用。

12、 結果 1．HCCLM<,6>增殖速度快，倍增時間短，為32.8小時。 2．HCCLM<,6>細胞株接種于免疫功能重建組(B組)及未重建組(C組)SCID小鼠皮下均可成瘤，成瘤率為100％，成瘤潛伏期分別為(9.83±1.47)d、(5.16±1.17)d，二組比較P<0.01；接種后5周移植瘤體積分別為(539.22±94.08)mm3、(1126.17±154.75)mm3，二組比較P<0.01；均有統(tǒng)計學差異。

13、 3．免疫功能重建荷瘤組(B組)接種后5周與免疫功能重建無腫瘤組(A組)SCID小鼠外周血有核細胞中人淋巴細胞比例CD3<'+>，CD4<'+>／CD8<'+>分別為B組：(2.17±0.50)％、1.19±0.66；A組(1.50±0.40)％、2.17±0.88，二組比較，P<,CD3>=0.04、P<,CD4／CD8>=0.08。人IgG含量分別為(61.68±5.66)ug/ml、(48.57±4.51)u g／ml，二

14、組比較P，CD4<'+>／CD8<'+>及人IgG含量第6周與第11周時分別為(1.60±0.32)％、2.36±0.74、(50.13±1.27)μg/m1與(1.50±0.40)％、2.17±0.88、(48.57±4.51)μg/m1，可以看出T淋巴細胞在第6周時已達高峰并可維持到第11周尚無明顯變化，而IgG含量雖有所下降，但并無統(tǒng)計學差異(P>0.05)

15、。 5．病理學檢查可見：B組腫瘤壞死明顯，未見遠處轉(zhuǎn)移；C組壞死程度明顯較輕，可見肺轉(zhuǎn)移。 6．免疫組織化學檢查：B組腫瘤組織中可見大量人源CD3<'+>，CD8<'+>細胞浸潤，壞死組織周圍更加明顯。C組移植瘤內(nèi)亦有腫瘤壞死，但未見人源淋巴細胞。 7．細胞毒試驗表明：B組脾臟細胞對HCCLM<,6>細胞的殺傷作用明顯，在效靶比例為120：1時，特異性殺傷率為(7.41±1.07)％、，C組脾細胞對肝癌細胞的殺傷