復方扶芳藤合劑對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞WNT信號通路的影響.pdf

1、目的:本研究采用體外細胞培養(yǎng)技術，建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)的體外培養(yǎng)體系;通過觀察復方扶芳藤合劑含藥血清對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖過程中WNT信號通路的調(diào)控作用，闡明復方扶芳藤合劑對BMSCs增值作用的機理，探索中藥復方抗衰老的新途徑。
　　 方法:1.運用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)純化BMSCs，通過細胞形態(tài)觀察不同階段細胞生長特征。2.通過臺盼藍染色法檢測BMSCs

2、的活性。3.MTT法繪制細胞生長曲線檢測BMSCs的增殖活性。4.流式細胞儀檢測BMSCs表面抗原標志和細胞周期。5.在成骨誘導液誘導下觀察BMSCs向成骨細胞分化能力。6.將30只SD大鼠隨機分為二組，每組15只，分別為復方扶芳藤合劑灌胃的藥物干預組和生理鹽水灌胃的陰性對照組;取灌胃后10％藥物血清及陰性對照組的血清分別對骨髓間充質(zhì)干細胞進行干預，運用MTT法檢測復方扶芳藤合劑對大鼠BMSCs增殖的影響。7.通過RT-PCR檢測Wnt

3、3a、β-catenin、c-myc的mRNA表達水平在干預前后的表達變化。8.通過免疫細胞化學方法檢測Wnt3a、β-catenin、c-myc的蛋白在干預前后的表達變化。
　　 結果:1.顯微鏡下觀察貼壁生長的BMSCs形態(tài)呈長梭形，呈融合成放射狀或旋渦狀，均勻一致。2.通過臺盼藍染色法檢測BMSCs的活性率為98.7％。3.BMSCs生長曲線分析結果顯示接種后第3天細胞進入指數(shù)增長期，至第7天進入平臺期。4.流式細胞儀檢測

4、BMSCs細胞周期檢測結果顯示G0/G1期的細胞約占88.45％。顯示BMSCs均一地表達細胞表面抗原CD44、CD90、CD105，陽性率分別為99.32％，99.33％，99.36％;而CD34呈陰性，陽性率為1.45％。5.經(jīng)成骨誘導液定向誘導分化后，細胞呈現(xiàn)成骨細胞的表型特征。6與生理鹽水陰性對照組相比，復方扶芳藤合劑含藥血清可明顯促進BMSCs增殖（P＜0.05）。7.RT-PCR顯示藥物干預組Wnt3a、β-catenin、

5、c-myc的mRNA表達水平均高于陰性對照組（P＜0.05）。8.免疫細胞化學顯示藥物干預組Wnt3a、β-catenin、c-myc蛋白表達均高于陰性對照組(P＜0.01)。
　　 結論:1.采用全骨髓貼壁法可獲得純度高、活性好的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，建立了穩(wěn)定培養(yǎng)體系，為我們對干細胞研究提供可靠的細胞來源。2.復方扶芳藤合劑含藥血清可促進BMSCs的增殖;在BMSCs增值過程中，復方扶芳藤合劑含藥血清可以使Wnt3a、β-c