RNA干擾技術(shù)阻斷PTEN基因表達對SACC-83細胞系的影響.pdf

1、背景:涎腺腺樣囊性癌是涎腺上皮來源的惡性程度最高的腫瘤之一，其顯著生物學(xué)特征為早期浸潤性，病患常常累及神經(jīng)，使患者因疼痛和神經(jīng)麻痹，導(dǎo)致相應(yīng)的功能障礙。手術(shù)切除是其首選的治療方法，根治性手術(shù)需要擴大切除，術(shù)后的復(fù)發(fā)率居高不下，并且預(yù)后較差，給患者帶來巨大痛苦，因此亟需更好的手段治療。致使腫瘤發(fā)生的因素很多，其中抑癌基因?qū)τ谀[瘤發(fā)生發(fā)展的作用極為重要，并成為腫瘤靶向治療的重要候補靶點。目前已發(fā)現(xiàn)一些與腺樣囊性癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的抑癌基因以

2、及癌基因，比如:P53、c-erbB-2、Beclinl等。PTEN基因的全稱為人類第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphataseand tensin homologue deleted chromatosome ten，PTEN)，作為迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重特異性磷酸酶作用的抑癌基因，近年來得到了廣泛關(guān)注。大量的研究顯示，PTEN基因在腫瘤細胞生長、細胞增殖及分化、細胞凋亡、細胞黏附能力、遷移和侵襲能力，及

3、其他腫瘤生物學(xué)行為起重要的調(diào)控作用，PTEN基因功能缺失可以影響多種組織來源腫瘤的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，但是在涎腺腺樣囊性癌的發(fā)生及發(fā)展過程中PTEN基因的作用尚少見文獻報道。SACC-83細胞系是1983年從一位26歲女性患者的舌下腺腺樣囊性癌的術(shù)后標(biāo)本中分離、培養(yǎng)并鑒定的，已被廣泛應(yīng)用在腫瘤發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移研究中，例如在SACC-83細胞系中將C-ebB2基因利用RNA干擾技術(shù)將其表達下調(diào)可以發(fā)現(xiàn)SACC-83細胞的增殖受到了抑制，但PTE

4、N基因在SACC-83細胞系的表達與作用尚未見報道。
　　目的:下調(diào)涎腺腺樣囊性癌SACC-83細胞系中抑癌基因PTEN的表達，在體外觀察PTEN對SACC-83細胞系生物學(xué)行為的改變，研究PTEN基因?qū)ο严傧贅幽倚园┌l(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用。
　　方法:利用Lipofectamine2000試劑盒將干擾RNA轉(zhuǎn)染到SACC-83細胞系中建立PTEN下調(diào)的細胞;在蛋白水平上應(yīng)用Western Blot實驗方法檢驗下調(diào)PTEN基因是

5、否成功;利用CCK8細胞增殖實驗和細胞克隆實驗研究PTEN基因下調(diào)后SACC-83細胞的增殖生長的情況;Brdu摻入實驗，進一步定位明確PTEN基因干擾下調(diào)后對SACC-83細胞增殖方面的影響;應(yīng)用Transwell和Matrigel建立體外人工基底膜侵襲模型，分析細胞的侵襲能力。另外應(yīng)用經(jīng)典的細胞劃痕實驗以及Transwell小室不加人工基底膜的方式，觀察SACC-83細胞的遷移能力。利用細胞黏附實驗，檢測細胞的黏附能力改變;應(yīng)用流式

6、細胞周期實驗分析細胞周期的變化。數(shù)據(jù)結(jié)果利用SPSS17.0進行分析。
　　結(jié)果:1.Western Blot結(jié)果顯示，干擾RNA轉(zhuǎn)染可在蛋白水平上成功下調(diào)SACC-83細胞中PTEN的表達。2.CCK8實驗、細胞克隆實驗以及Brdu摻入實驗的結(jié)果分析顯示，PTEN基因下調(diào)后SACC-83細胞的增殖能力增強。3.Transwell加Matrigel膠實驗顯示，細胞干擾后穿越小室的細胞數(shù)量增多，說明細胞對基底膜侵襲能力提高。應(yīng)用Tr

7、answell不加Matrigel膠建立的體外細胞運動模型和細胞劃痕實驗表明，PTEN基因下調(diào)組細胞的遷移能力明顯下降。4.細胞黏附實驗顯示，PTEN基因下調(diào)組的黏附能力增強。5.流式細胞周期實驗結(jié)果顯示，PTEN基因下調(diào)細胞在S期細胞數(shù)量比例增大;G1期的細胞比例減少。
　　結(jié)論:在體外培養(yǎng)的涎腺腺樣囊性癌SACC-83細胞中下調(diào)PTEN基因表達，可以顯著促進細胞增殖、侵襲、遷移和黏附能力，提示了抑癌基因PTEN可調(diào)控涎腺腺樣囊