RNA干擾技術(shù)阻斷黏著斑激酶表達(dá)對肝星狀細(xì)胞膠原代謝的影響.pdf

1、肝硬化是威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，而肝纖維化是肝硬化形成的共有病理改變和必經(jīng)途徑。因此，如何阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化是治療各種慢性肝病、預(yù)防肝硬化的關(guān)鍵。
　　 肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）是肝臟合成膠原的最主要細(xì)胞；HSC活化、增殖、遷移進(jìn)而合成大量的膠原等細(xì)胞外間質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。
　　 黏著斑激酶（focal ad

2、hesion kinase，F(xiàn)AK）在整合素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究顯示，F(xiàn)AK磷酸化后與多種器官組織纖維化疾病有關(guān)，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中亦發(fā)揮重要作用。我們的前期研究表明，膽總管結(jié)扎大鼠纖維化肝組織中FAK表達(dá)增強(qiáng)，F(xiàn)AK磷酸化后可以促進(jìn)HSC的膠原合成，且在體外運(yùn)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法使外源性黏著斑激酶相關(guān)非激酶（FAK related non-kinase，F(xiàn)RNK）在HSC過表達(dá)，可以抑制HSC的膠原合成。因此，我們推測

3、抑制體內(nèi)FAK的活化和表達(dá)可能成為逆轉(zhuǎn)肝纖維化的新靶點(diǎn)和新方向。
　　 RNA干擾（RNA interference，RNAi）能高效特異地抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)相應(yīng)蛋白水平及功能，是目前研究基因功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最有力工具。
　　 為此，我們采用RNAi技術(shù)，在陽離子聚合物介導(dǎo)下將干擾質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HSC，進(jìn)一步研究特異性阻斷FAK表達(dá)對纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）刺激的HSC膠原代謝的影響及其機(jī)制

4、，為肝纖維化的治療提供理論依據(jù)。
　　 目的：應(yīng)用FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC，探討特異性阻斷FAK表達(dá)對FN刺激的HSCⅠ、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響，以及該過程中MMP-13、TIMP-1、MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP的表達(dá)變化。
　　 方法：應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在陽離子聚合物介導(dǎo)下瞬時(shí)轉(zhuǎn)染FAK shRNA質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)分為五組：①空白對照組（簡寫為Con）；②FN刺激組（簡寫為FN）；③轉(zhuǎn)染試劑組（簡寫為S

5、ofast）；④陰性對照組pEGFP-HK（簡寫為HK組）；⑤pEGFP-FAK shRNA干擾組（簡稱為FAK shRNA組）。②～⑤組中FN濃度均為10μg·mL-1。采用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率，采用Western blot和real-time Q-PCR技術(shù)檢測FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后FAK與Ⅰ型膠原的蛋白和mRNA表達(dá)；real-time Q-PCR技術(shù)檢測FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)情況

6、；Western blot和real-time Q-PCR技術(shù)檢測MMP-13、TIMP-1、MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP表達(dá)。
　　 結(jié)果：①轉(zhuǎn)染后48 h，利用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)轉(zhuǎn)染成功，轉(zhuǎn)染效率約40％； Western blot分析，F(xiàn)AK shRNA轉(zhuǎn)染后48 h，可顯著下調(diào)FAK蛋白的表達(dá)，蛋白下調(diào)率為72.53％； real-timeQ-PCR結(jié)果顯示FAK shRNA下調(diào)FAK mRNA的表達(dá)

7、，F(xiàn)AK shRNA轉(zhuǎn)染HSC24 h后下調(diào)率為76.73％；②FAK shRNA抑制Ⅰ型膠原mRNA和蛋白的表達(dá)：real-time Q-PCR結(jié)果顯示，與HK組相比，F(xiàn)AK shRNA組Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)明顯減少，最高下調(diào)點(diǎn)出現(xiàn)于FAKshRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC后36 h（0.69±0.03 vs1.96±0.15），下調(diào)率為64.80％； Western blot結(jié)果顯示FN組Ⅰ型膠原蛋白的合成顯著高于Con組，F(xiàn)AK shRNA

8、組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)同HK組相比顯著下降，最高下調(diào)點(diǎn)出現(xiàn)于FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC后48 h（0.85±0.03vs2.58±0.21），下調(diào)率為67.05％；③FAK shRNA抑制Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)：real-time Q-PCR結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)錄水平上，F(xiàn)N組Ⅲ型膠原的合成顯著高于Con組，F(xiàn)AK shRNA組Ⅲ型膠原的合成同HK組相比顯著下降，最高下調(diào)點(diǎn)出現(xiàn)于FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC后36h（0.59±0.07 v

9、s1.62±0.12），下調(diào)率為63.58％；④FAK shRNA上調(diào)MMP-13 mRNA和蛋白的表達(dá)：real-time Q-PCR和Western blot結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上，F(xiàn)N組MMP-13的表達(dá)顯著低于Con組，而FAK shRNA組MMP-13 mRNA和蛋白的表達(dá)較HK組顯著增加，最高上調(diào)點(diǎn)分別出現(xiàn)于FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC后36 h和48 h（1.24±0.04 vs0.79±0.03，1.74±0.2

10、0 vs1.09±0.09），上調(diào)率分別為56.96％和59.63％；⑤FAK shRNA抑制TIMP-1mRNA和蛋白的表達(dá)：real-time Q-PCR和Western blot結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上，F(xiàn)N組TIMP-1的表達(dá)顯著高于Con組，而FAK shRNA組TIMP-1的表達(dá)較HK組顯著下降，最高下調(diào)點(diǎn)分別出現(xiàn)于FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC后36 h和48 h（0.49±0.02 vs1.72±0.10，0.76±

11、0.08 vs2.31±0.24），下調(diào)率分別為71.51％和67.10％；⑥FAK shRNA下調(diào)TIMP-1/MMP-13比值：無論是在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平上，F(xiàn)N組TIMP-1/MMP-13比值均較Con組升高，P<0.05，但與Sofast組、HK組比較無明顯差異，P>0.05，F(xiàn)AK shRNA組TIMP-1/MMP-13比值明顯低于HK組，最高下調(diào)點(diǎn)分別出現(xiàn)于FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC后36h和48 h（0.42±0

12、.03vs2.19±0.17，0.44±0.01 vs2.11±0.05），下調(diào)率分別為80.82％和79.15％；⑦FAK shRNA上調(diào)MT1-MMP mRNA和蛋白的表達(dá)：在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上，F(xiàn)N組MT1-MMP的表達(dá)均顯著低于Con組，而FAK shRNA組MT1-MMP mRNA和蛋白的表達(dá)較HK組顯著增加，最高上調(diào)點(diǎn)分別出現(xiàn)于FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后36 h和48 h（1.41±0.08 vs0.85±0.04，1.72

13、±0.10 vs1.06±0.12），上調(diào)率分別為65.88％和62.26％；⑧FAK shRNA上調(diào)MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)：在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上，F(xiàn)N組MMP-2的表達(dá)顯著低于Con組，而FAK shRNA組MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)較HK組顯著增加，最高上調(diào)點(diǎn)分別出現(xiàn)于FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC后36h和48 h（1.36±0.06 vs0.82±0.02，1.33±0.05 vs0.80±0.05），上調(diào)率分別

14、為65.85％和66.25％；⑨FAKshRNA抑制TIMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)：在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上；FN組TIMP-2的表達(dá)顯著高于Con組，F(xiàn)AK shRNA組TIMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)較HK組顯著下降，最高下調(diào)點(diǎn)分別出現(xiàn)于FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC后36 h和48 h（0.73±0.03 vs1.54±0.04，0.53±0.08 vs1.31±0.02），下調(diào)率分別為52.60％和59.54％；⑩FAK sh

15、RNA下調(diào)TIMP-2/MMP-2比值：無論是在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平上，F(xiàn)N組TIMP-2/MMP-2比值較Con組升高，F(xiàn)AK shRNA組TIMP-2/MMP-2比值顯著低于HK組，最高下調(diào)點(diǎn)分別出現(xiàn)于FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC后36h和48 h（0.54±0.05 vs1.88±0.08，0.40±0.05 vs1.64±0.13），下調(diào)率分別為71.28％和75.61％。
　　 結(jié)論：在陽離子聚合物介導(dǎo)下瞬時(shí)轉(zhuǎn)染