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文檔簡(jiǎn)介
1、天然免疫系統(tǒng)是宿主抵抗病原微生物的第一道防線,也是獲得性免疫的基礎(chǔ)。干擾素信號(hào)通路作為機(jī)體抵抗病毒感染所作出的重要應(yīng)答機(jī)制,一直是病毒學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。miRNA作為一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控機(jī)制,廣泛參與時(shí)序發(fā)育、神經(jīng)元發(fā)育、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、脂肪代謝、激素分泌等多種生命過(guò)程。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),miRNA在天然免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要的負(fù)反饋調(diào)控功能。本研究選擇了抗病毒天然免疫信號(hào)通路中的幾個(gè)關(guān)鍵信號(hào)分子作為對(duì)象,希望通過(guò)發(fā)掘靶
2、向這些關(guān)鍵基因的miRNA,加深對(duì)miRNA參與的負(fù)調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。為今后miRNA的功能研究和開(kāi)發(fā)miRNA作為疾病診斷和治療的靶標(biāo)提供理論依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容包括以下幾方面:
1.篩選poly(dAT:dAT)誘導(dǎo)的差異表達(dá)miRNA及其功能研究
dsRNA/DNA、細(xì)菌的內(nèi)毒素脂多糖和細(xì)菌的鞭毛可以被宿主的免疫系統(tǒng)的模式識(shí)別受體識(shí)別并觸發(fā)免疫反應(yīng)。LPS和dsRNA觸發(fā)的免疫反應(yīng)所引起的miRNA差異表達(dá)
3、及這些miRNA在免疫反應(yīng)過(guò)程中的功能已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和確定。但是,作為病毒在感染侵入宿主細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物,dsDNA刺激誘導(dǎo)的miRNA的差異表達(dá)研究尚不清楚。為了篩選dsDNA誘導(dǎo)的顯著差異表達(dá)的miRNA,本研究選用dsDNA的模擬物poly(dAT:dAT)作為刺激物,通過(guò)miRNA芯片技術(shù),篩選了poly(dAT:dAT)刺激HEK-293細(xì)胞后差異表達(dá)的miRNA。發(fā)現(xiàn)miR-518b,miR-492,miR-181a
4、和miR-331-3p等10條miRNA的表達(dá)顯著上調(diào);miR-383,miR-618,let-7a等5條miRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。利用miRNA特異性Real-Time PCR驗(yàn)證了芯片結(jié)果。通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)和熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)其中上調(diào)表達(dá)的miR-181a可能通過(guò)靶向DAI基因負(fù)性調(diào)節(jié)干擾素信號(hào)通路。
2.篩選調(diào)控IL-6基因表達(dá)的miRNA及其機(jī)制研究
白細(xì)胞介素6(IL-6)是一種重要的炎性細(xì)胞
5、因子。細(xì)胞在受到致炎性刺激時(shí),IL-6的表達(dá)量顯著上調(diào),并促進(jìn)其它炎性細(xì)胞因子或者趨化因子的分泌,從而加重炎癥反應(yīng),加速外源異物的清除。但是IL-6表達(dá)的紊亂對(duì)機(jī)體是有損害的,過(guò)量的IL-6會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的炎癥,并可能最終導(dǎo)致持續(xù)炎癥組織發(fā)生癌變。因此,維持IL-6正常表達(dá)的負(fù)調(diào)控機(jī)制就顯得至關(guān)重要。據(jù)此,本研究利用生物信息學(xué)方法,預(yù)測(cè)可能結(jié)合于IL-63'UTR區(qū)域的miRNA。利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng),篩選到負(fù)調(diào)控IL-6表達(dá)的miR-36
6、5。通過(guò)構(gòu)建IL-63'UTR突變體的報(bào)告質(zhì)粒,確定了miR-365結(jié)合于IL-63'UTR的精細(xì)位點(diǎn)。利用ELISA方法,證實(shí)miR-365可以從蛋白水平對(duì)IL-6進(jìn)行負(fù)調(diào)控,而且這種負(fù)調(diào)控是通過(guò)抑制IL-6蛋白的翻譯而不是影響其mRNA的穩(wěn)定性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。對(duì)miR-365啟動(dòng)子區(qū)域的分析,發(fā)現(xiàn)NF-κB和Sp1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控miR-365的轉(zhuǎn)錄。利用MAPK/ERK的抑制劑發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK是miR-365上游重要的信號(hào)通路。
7、進(jìn)一步對(duì)miR-365潛在靶基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)miR-365還可能通過(guò)間接途徑調(diào)控IL-6的表達(dá)。
3.篩選靶向TBK-1的miRNA及其機(jī)制研究
TBK-1是Ⅰ型干擾素信號(hào)通路中的重要信號(hào)分子,主要功能是磷酸化轉(zhuǎn)錄因子IRF3和IRF7,促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)定位并最終啟始IFN-β的轉(zhuǎn)錄。TLR或RIG-I/MDA5依賴的抗病毒信號(hào)通路在TBK-1/IRF3節(jié)段交匯,充分說(shuō)明TBK-1激酶在整個(gè)抗病毒免疫系統(tǒng)中不可
8、替代的重要性。為了發(fā)掘可能通過(guò)靶向TBK-1負(fù)調(diào)控干擾素信號(hào)通路的miRNA,本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-155可能靶向TBK-1,利用TBK-1-3'UTR的報(bào)告質(zhì)粒證實(shí)了miR-155對(duì)TBK-1表達(dá)的抑制作用;過(guò)表達(dá)miR-155顯著抑制TBK-1蛋白的表達(dá),而miR-155抑制劑則增強(qiáng)TBK-1蛋白的表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)了miR-155對(duì)TBK-1表達(dá)的負(fù)調(diào)控作用。利用TBK-13'UTR的突變體報(bào)告質(zhì)粒,確定了miR-155與
9、TBK-13'UTR區(qū)域的精確結(jié)合位點(diǎn)。在證實(shí)miR-155對(duì)TBK-1的負(fù)調(diào)控作用后,進(jìn)一步利用IRF3、NF-κB和IFN-β的啟動(dòng)子熒光素報(bào)告質(zhì)粒,證實(shí)miR-155過(guò)表達(dá)顯著抑制IRF3和NF-κB的活性,并最終抑制IFN-β的轉(zhuǎn)錄。對(duì)TBK-1的Knockdown和Gain-of function assay的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)miR-155負(fù)調(diào)控干擾素信號(hào)通路是通過(guò)靶向TBK-1而實(shí)現(xiàn)的。為了進(jìn)一步證實(shí)miR-155對(duì)干擾素表達(dá)
10、的抑制作用,檢測(cè)了miR-155過(guò)表達(dá)對(duì)VSV和SEV增殖的影響,發(fā)現(xiàn)miR-155可通過(guò)抑制poly(dAT:dAT)誘導(dǎo)的干擾素表達(dá)而促進(jìn)VSV和SEV在HEK-293中的增殖。研究還發(fā)現(xiàn)poly(dAT:dAT)刺激顯著誘導(dǎo)miR-155的表達(dá),且NF-κB和MAPK是調(diào)控miR-155表達(dá)的重要通路。這些結(jié)果表明,可誘導(dǎo)的miR-155的表達(dá)在Ⅰ型干擾素信號(hào)通路中扮演著重要的負(fù)調(diào)控機(jī)制。
4.篩選靶向JAK-1的m
11、iRNA及其機(jī)制研究
JAK-STAT信號(hào)通路是連接干擾素和下游干擾素刺激基因的重要信號(hào)通路。JAK-1是Janus非受體型絡(luò)氨酸激酶家族的成員之一。干擾素與細(xì)胞表面受體結(jié)合后,JAK-1磷酸化STAT家族中的兩個(gè)成員STAT-1和STAT-2,促使其發(fā)生向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)定位并誘導(dǎo)干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄激活。除干擾素之外,JAK-1在IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,IL-13等細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中也發(fā)揮重要功能。到
12、目前為止,還沒(méi)有關(guān)于miRNA調(diào)控JAK-1表達(dá)的報(bào)道。為了發(fā)掘靶向JAK-1的miRNA,本研究預(yù)測(cè)并證實(shí)miR-23a通過(guò)直接與3'UTR結(jié)合的方式負(fù)調(diào)控JAK-1基因的表達(dá)。通過(guò)結(jié)合位點(diǎn)的突變分析,確定了miR-23a和JAK-1相互作用的精細(xì)位點(diǎn)。同時(shí),發(fā)現(xiàn)miR-23a過(guò)表達(dá)顯著抑制JAK-1的蛋白表達(dá),且主要是通過(guò)降低mRNA的穩(wěn)定性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。過(guò)表達(dá)miR-23a對(duì)ISRE的活性及下游ISG的表達(dá)也有明顯的抑制效應(yīng)。用pol
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