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文檔簡介
1、天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體識(shí)別“非我”、抵御病原體入侵的第一道防線,通過模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)識(shí)別細(xì)菌、病毒等病原體的入侵,進(jìn)而誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子及Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,在機(jī)體識(shí)別、清除病原體的過程中具有非常重要的作用。其中,Ⅰ型干擾素IFN-β由Ifnb基因編碼產(chǎn)生,在抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用,它的產(chǎn)生受到細(xì)胞內(nèi)多種分子的共同調(diào)控,如干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon reg
2、ulatory factors,IRFs)、共活化因子(co-activator)、組蛋白修飾酶等,這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)協(xié)同作用,共同實(shí)現(xiàn)對(duì)Ifnb基因轉(zhuǎn)錄的精密調(diào)控。然而,目前對(duì)Ⅰ型干擾素轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,尤其是表觀修飾相關(guān)的調(diào)控機(jī)制還知之甚少。
Brd3(Bromodomain protein3)是BET(Bromodomain and extraterminal motifprote ins)蛋白質(zhì)家族的一員。BET蛋白作為
3、表觀調(diào)控分子,參與了多種細(xì)胞生命活動(dòng)。研究證實(shí)這一家族成員功能多樣,他們能夠作為骨架蛋白招募不同的蛋白質(zhì)至轉(zhuǎn)錄位點(diǎn);參與細(xì)胞周期的調(diào)控;結(jié)合不同轉(zhuǎn)錄分子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄等。近年來一些研究發(fā)現(xiàn),BET家族成員Brd4(Bromodomain protein4)能夠與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合并對(duì)NF-κB目標(biāo)基因進(jìn)行調(diào)控,提示BET蛋白可能在天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。我們前期利用基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在VSV刺激的巨噬細(xì)胞中,Brd3的表達(dá)水平下降了近
4、2倍,提示Brd3可能參與了病毒觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答。因此在本課題中,我們研究了Brd3分子在病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用,并對(duì)Brd3調(diào)控天然免疫應(yīng)答的機(jī)制進(jìn)行了初步探索。
我們首先對(duì)Brd3是否參與病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答進(jìn)行了驗(yàn)證。我們利用Q-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了小鼠組織器官和免疫細(xì)胞中Brd3分子的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)Brd3分子廣泛表達(dá)于小鼠免疫器官和免疫細(xì)胞。接著我們利用Q-PCR和Western blot
5、實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Brd3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平在病毒及LPS刺激后顯著下降。同時(shí)我們利用CRISPR-CAS9技術(shù)構(gòu)建了Brd3敲除的RAW264.7細(xì)胞系,利用此細(xì)胞系,我們檢測(cè)了病毒及LPS刺激后細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和Ⅰ型干擾素IFN-β的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在Brd3敲除的細(xì)胞中,病毒及LPS誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素IFN-β的產(chǎn)生相比于對(duì)照細(xì)胞顯著減少,IL-6的表達(dá)水平有輕微降低,而TNF-α的表達(dá)沒有差異。因此,在第一部分的研究中,
6、我們發(fā)現(xiàn)Brd3參與了病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答,且能促進(jìn)Ⅰ型干擾素IFN-β的產(chǎn)生。
接著,我們對(duì)Brd3促進(jìn)IFN-β產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行了探索。我們首先利用WB對(duì)調(diào)控IFN-β產(chǎn)生的信號(hào)通路進(jìn)行了篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Brd3不影響轉(zhuǎn)錄因子IRF3、p65轉(zhuǎn)位入核。接著我們利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Brd3能夠與轉(zhuǎn)錄因子IRF3、共活化分子p300結(jié)合,Brd3能夠促進(jìn)IRF3與p300相互作用,它們?nèi)呖赡茏鳛橐粋€(gè)復(fù)合物共同調(diào)控對(duì)基
7、因的轉(zhuǎn)錄;同時(shí),我們利用過表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Brd3能促進(jìn)p300介導(dǎo)的IRF3的乙酰化修飾。最后我們利用染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Brd3對(duì)IRF3和p300在Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)募集的影響,并檢測(cè)了Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3和H4的乙?;癄顟B(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Brd3敲除的細(xì)胞中,IRF3和p300向Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)的募集相比于對(duì)照細(xì)胞顯著降低,同時(shí)組蛋白H3和H4的乙酰化水平明顯下降。因此,在第二部分的研究中,我們發(fā)現(xiàn)Brd3能夠通過促
8、進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子IRF3與共活化分子p300相互作用,并招募IRF3/p300復(fù)合物向Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)IFN-β的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
綜上所述,我們研究了Brd3在病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用,并在分子水平上探索了Brd3促進(jìn)Ⅰ型干擾素IFN-β產(chǎn)生的機(jī)制。本項(xiàng)研究揭示了表觀調(diào)控分子Brd3在天然免疫調(diào)控中的重要作用,拓展了人們對(duì)BET分子功能和作用的認(rèn)識(shí),有助于更好地了解病毒誘導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制,從
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