Brd3對病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答的調(diào)控及其機(jī)制研究.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體識別“非我”、抵御病原體入侵的第一道防線，通過模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）識別細(xì)菌、病毒等病原體的入侵，進(jìn)而誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子及Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，在機(jī)體識別、清除病原體的過程中具有非常重要的作用。其中，Ⅰ型干擾素IFN-β由Ifnb基因編碼產(chǎn)生，在抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，它的產(chǎn)生受到細(xì)胞內(nèi)多種分子的共同調(diào)控，如干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon reg

2、ulatory factors，IRFs)、共活化因子(co-activator)、組蛋白修飾酶等，這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)協(xié)同作用，共同實(shí)現(xiàn)對Ifnb基因轉(zhuǎn)錄的精密調(diào)控。然而，目前對Ⅰ型干擾素轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，尤其是表觀修飾相關(guān)的調(diào)控機(jī)制還知之甚少。
　　Brd3(Bromodomain protein3)是BET(Bromodomain and extraterminal motifprote ins)蛋白質(zhì)家族的一員。BET蛋白作為

3、表觀調(diào)控分子，參與了多種細(xì)胞生命活動。研究證實(shí)這一家族成員功能多樣，他們能夠作為骨架蛋白招募不同的蛋白質(zhì)至轉(zhuǎn)錄位點(diǎn);參與細(xì)胞周期的調(diào)控;結(jié)合不同轉(zhuǎn)錄分子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄等。近年來一些研究發(fā)現(xiàn)，BET家族成員Brd4（Bromodomain protein4）能夠與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合并對NF-κB目標(biāo)基因進(jìn)行調(diào)控，提示BET蛋白可能在天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。我們前期利用基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，在VSV刺激的巨噬細(xì)胞中，Brd3的表達(dá)水平下降了近

4、2倍，提示Brd3可能參與了病毒觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答。因此在本課題中，我們研究了Brd3分子在病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用，并對Brd3調(diào)控天然免疫應(yīng)答的機(jī)制進(jìn)行了初步探索。
　　我們首先對Brd3是否參與病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答進(jìn)行了驗(yàn)證。我們利用Q-PCR實(shí)驗(yàn)檢測了小鼠組織器官和免疫細(xì)胞中Brd3分子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Brd3分子廣泛表達(dá)于小鼠免疫器官和免疫細(xì)胞。接著我們利用Q-PCR和Western blot

5、實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Brd3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平在病毒及LPS刺激后顯著下降。同時(shí)我們利用CRISPR-CAS9技術(shù)構(gòu)建了Brd3敲除的RAW264.7細(xì)胞系，利用此細(xì)胞系，我們檢測了病毒及LPS刺激后細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和Ⅰ型干擾素IFN-β的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Brd3敲除的細(xì)胞中，病毒及LPS誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素IFN-β的產(chǎn)生相比于對照細(xì)胞顯著減少，IL-6的表達(dá)水平有輕微降低，而TNF-α的表達(dá)沒有差異。因此，在第一部分的研究中，

6、我們發(fā)現(xiàn)Brd3參與了病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答，且能促進(jìn)Ⅰ型干擾素IFN-β的產(chǎn)生。
　　接著，我們對Brd3促進(jìn)IFN-β產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行了探索。我們首先利用WB對調(diào)控IFN-β產(chǎn)生的信號通路進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Brd3不影響轉(zhuǎn)錄因子IRF3、p65轉(zhuǎn)位入核。接著我們利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Brd3能夠與轉(zhuǎn)錄因子IRF3、共活化分子p300結(jié)合，Brd3能夠促進(jìn)IRF3與p300相互作用，它們?nèi)呖赡茏鳛橐粋€(gè)復(fù)合物共同調(diào)控對基

7、因的轉(zhuǎn)錄;同時(shí)，我們利用過表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Brd3能促進(jìn)p300介導(dǎo)的IRF3的乙酰化修飾。最后我們利用染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測了Brd3對IRF3和p300在Ifnb基因啟動子區(qū)募集的影響，并檢測了Ifnb基因啟動子區(qū)組蛋白H3和H4的乙?；癄顟B(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Brd3敲除的細(xì)胞中，IRF3和p300向Ifnb基因啟動子區(qū)的募集相比于對照細(xì)胞顯著降低，同時(shí)組蛋白H3和H4的乙?；矫黠@下降。因此，在第二部分的研究中，我們發(fā)現(xiàn)Brd3能夠通過促

8、進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子IRF3與共活化分子p300相互作用，并招募IRF3/p300復(fù)合物向Ifnb基因啟動子區(qū)結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)IFN-β的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
　　綜上所述，我們研究了Brd3在病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用，并在分子水平上探索了Brd3促進(jìn)Ⅰ型干擾素IFN-β產(chǎn)生的機(jī)制。本項(xiàng)研究揭示了表觀調(diào)控分子Brd3在天然免疫調(diào)控中的重要作用，拓展了人們對BET分子功能和作用的認(rèn)識，有助于更好地了解病毒誘導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制，從