馬鈴薯黑脛病菌致病相關(guān)基因pgl的功能與RTFQ-LAMP分子檢測(cè)方法研究.pdf

1、由馬鈴薯黑脛果膠桿菌（Pectobacterium atrosepticum）引起的馬鈴薯黑脛病是各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生、危害嚴(yán)重的細(xì)菌性種傳病害。當(dāng)前對(duì)病菌致病基因功能的研究是植物病理學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和焦點(diǎn)，而馬鈴薯黑脛病菌JG10-08菌株的全基因組測(cè)序?yàn)樵摼虏∠嚓P(guān)基因功能的驗(yàn)證提供了豐富信息和切入點(diǎn)。本項(xiàng)目利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)了endo-PGLI和exo-PGLA的結(jié)構(gòu)與功能，并通過分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其致病基因功能進(jìn)行了驗(yàn)證?；?/p>

2、P.atrosepticum gyrB種特異性基因序列，建立了實(shí)時(shí)熒光定量環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RTFQ-LAMP)分子檢測(cè)方法。該研究的主要結(jié)果如下:
　　1.預(yù)測(cè)了endo-PGLI和exo-PGLA的結(jié)構(gòu)與功能:在分析蛋白序列及基本性質(zhì)的基礎(chǔ)上，利用ANTHEPROT5.0軟件分析endo-PGLI和exo-PGLA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，均主要由α-螺旋和β-折疊組成。通過SWISS-MODEL蛋白同源模建數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示

3、，endo-PGLI蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)是一種馬鞍狀，exo-PGLA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)是一種扁筒狀。利用NCBI中的CDD數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析保守結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)，確定了endo-PGLI氨基酸序列13-568位為周質(zhì)果膠酸裂解酶家族Pectate_lyase_2保守結(jié)構(gòu)域，exo-PGLA氨基酸序列478-646位為果膠酸裂解酶家族β-折疊保守結(jié)構(gòu)域。endo-PGLI和exo-PGLA均具有降解植物細(xì)胞壁果膠成分的致病功能。
　　2.分別敲

4、除與回復(fù)了基因endo-pglI和exo-pglA，獲得突變株和回復(fù)株:構(gòu)建自殺載體，利用同源重組雙交換原理，敲除了馬鈴薯黑脛病菌P.atrosepticum野生型菌株JG10-08中目的基因endo-pglI和exo-pglA，獲得了兩株突變株△JG10-08endo-pglI和△JG10-08exo-pglA。將目的基因endo-pglI和exo-pglA回復(fù)到突變株中，得到回復(fù)株△△JG10-08endo-pglI和△△JG10-

5、08exo-pglA。
　　3.驗(yàn)證了endo-pglI和exo-pglA致病基因功能:用注射法分別將野生型菌株JG10-08和突變株△JG10-08endo-pglI和△JG10-08exo-pglA接種到馬鈴薯植株莖基部，7天后突變株△JG10-08endo-pglI和△JG10-08exo-pglA接種處周圍有輕微的發(fā)病癥狀，其病情指數(shù)分別為19.26和20.74;而接種野生型菌株JG10-08的植株莖基部發(fā)病嚴(yán)重，接種處出

6、現(xiàn)腐爛癥狀，其病情指數(shù)高達(dá)50.37。利用浸泡法分別將野生型菌株JG10-08和突變株△JG10-08endo-pglI和△JG10-08exo-pglA接種馬鈴薯塊莖，7天后，突變株△JG10-08endo-pglI和△JG10-08exo-pglA接種的塊莖表面出現(xiàn)了輕微的褐色斑點(diǎn)，病情指數(shù)分別為16.30和18.52。野生型菌株JG10-08接種的馬鈴薯塊莖已經(jīng)開始腐爛，病情指數(shù)為47.41?；貜?fù)株對(duì)馬鈴薯植株和塊莖的致病性和野生

7、型菌株相比無顯著性差異。這表明endo-pglI和exo-pglA兩個(gè)基因在黑脛病菌致病性中發(fā)揮著重要作用。
　　4.設(shè)計(jì)并獲得了用于P.atrosepticum RTFQ-LAMP檢測(cè)的特異引物:基于Pectobacterium屬gyrB基因種內(nèi)保守序列，設(shè)計(jì)了一套種特異性引物，包括上游外引物(FOP)，下游外引物(BOP)，上游內(nèi)引物(FIP)，下游內(nèi)引物(BIP)，上游環(huán)引物(FLP)和下游環(huán)引物(BLP)。采用8株不同來源

8、P.atrosepticum的菌株和55株近緣種屬菌株驗(yàn)證了引物的特異性。
　　5.建立了實(shí)時(shí)熒光定量環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法:優(yōu)化反應(yīng)體系中的Mg2+、dNTPs、引物等，確定25μL最佳反應(yīng)體系為:10×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液2.5μL、10μmol/L的內(nèi)引物各3.2μL、外引物各0.8μL、環(huán)引物各1.6μL、50mmol/L MgSO40.5μL、10mmol/L dNTPs1.5μL、10mol/L甜菜堿1.0μL、

9、8U的Bst DNA聚合酶1.0μL、10000×SYBR GreenⅠ（1∶200稀釋）0.3μL、DNA模板2μL和滅菌ddH2O5μL。最佳反應(yīng)溫度為61℃，反應(yīng)時(shí)間為40min。RTFQ-LAMP檢測(cè)純培養(yǎng)的P.atrosepticum DNA的靈敏度為58.9fg/反應(yīng)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示相關(guān)系數(shù)為0.9991，相應(yīng)菌液濃度為3.1CFU/反應(yīng);人工添加馬鈴薯樣品中P.atrosepticum的RTFQ-LAMP檢出限是2.2×1

10、02CFU/g。
　　6.田間黑脛病實(shí)際檢測(cè):從田間病株同壟兩側(cè)及相鄰壟兩側(cè)各取2株馬鈴薯植株，即在病株同壟兩側(cè)取420塊馬鈴薯塊莖和在病株相鄰壟兩側(cè)取420塊馬鈴薯塊莖進(jìn)行RTFQ-LAMP檢測(cè)，病株同壟和病株相鄰壟的P.atrosepticum陽性檢出率分別為55.2％和36.7％，表明病株同壟比病株相鄰壟黑脛病發(fā)病嚴(yán)重。從田間無癥狀植株、發(fā)病株及病株周圍取馬鈴薯塊莖1260塊進(jìn)行RTFQ-LAMP和普通PCR檢測(cè)，RTFQ-