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文檔簡(jiǎn)介
1、膽道閉鎖(biliary atresia,BA)是兒童最常見(jiàn)的嚴(yán)重肝臟疾病,病因至今未明,既往的研究多局限于某些炎癥細(xì)胞或因子在發(fā)病中的作用,但是不同的細(xì)胞與細(xì)胞間,分子與分子間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系,這些細(xì)胞和因子哪些處于始動(dòng)環(huán)節(jié),哪些處于核心通路或是相應(yīng)的下游環(huán)節(jié),始終未能闡明。為進(jìn)一步闡明該病的發(fā)病機(jī)制,本研究借助基因芯片及生物信息學(xué)技術(shù)在全基因組水平對(duì)基因表達(dá)譜及基因間的相互關(guān)系進(jìn)行研究。對(duì)于所得到的關(guān)鍵基因?qū)ζ湓谀懙篱]鎖肝臟中的表
2、達(dá)及突變情況進(jìn)行了驗(yàn)證。同時(shí)在體外細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)可能存在的關(guān)鍵調(diào)控基因的功能進(jìn)行深入研究。
第一部分膽道閉鎖基因表達(dá)譜特點(diǎn)及生物信息學(xué)分析
目的:利用基因芯片技術(shù)及生物信息學(xué)方法對(duì)膽道閉鎖的基因表達(dá)譜進(jìn)行研究,以進(jìn)一步闡明該病的發(fā)病機(jī)制。
方法Trizol一步法提取膽道閉鎖組及膽總管囊腫組肝臟組織的總RNA,利用人全基因組基因表達(dá)芯片研究膽道閉鎖及膽總管囊腫肝臟組織基因表達(dá)譜間的差異,并對(duì)所得差異基因進(jìn)行表達(dá)
3、趨勢(shì)顯著性及功能分析、信號(hào)傳導(dǎo)通路顯著性分析,并構(gòu)建基因間相互作用網(wǎng)絡(luò),尋找在膽道閉鎖發(fā)病過(guò)程中的顯著性的基因表達(dá)趨勢(shì)、信號(hào)通路及關(guān)鍵調(diào)控基因。
結(jié)果:膽道閉鎖與膽總管囊腫相比存在1000余條差異基因;通過(guò)對(duì)表達(dá)譜芯片所得差異基因的分析,得到:
(1)趨勢(shì)21及23兩個(gè)最具顯著性的表達(dá)趨勢(shì)。趨勢(shì)21的基因功能主要涉及組織相容性抗原復(fù)合物Ⅱ介導(dǎo)的外源性抗原呈遞作用以及由此導(dǎo)致的免疫反應(yīng)。趨勢(shì)23的基因功能主要涉及器官組
4、織發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)形成,陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)與磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)運(yùn)。
(2)趨勢(shì)21涉及的顯著性通路主要為細(xì)胞凋亡調(diào)控(與炎癥及組織重構(gòu)有關(guān)),細(xì)胞基質(zhì)代謝以及細(xì)胞粘附、花生四烯酸類物質(zhì)的合成(與炎癥反應(yīng)相關(guān));趨勢(shì)23主要涉及細(xì)胞基質(zhì)代謝(參與組織重構(gòu))、炎癥反應(yīng)、花生四烯酸類物質(zhì)的合成、增殖與遷移能力。
(3)其中趨勢(shì)21的關(guān)鍵基因包括ITGAM、ITGB2、TNFSFR21、RGS19,趨勢(shì)23的關(guān)鍵基因包括LAMC1、LAMA
5、5、MMP7、TIMP2、MMP11。
(4)通過(guò)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建發(fā)現(xiàn)LDOC1基因可能在膽道閉鎖發(fā)病中起關(guān)鍵調(diào)控作用。
結(jié)論:
(1)膽道閉鎖的發(fā)病與MHCⅡ類分子介導(dǎo)免疫炎癥及組織重構(gòu)密切相關(guān)。
(2)其中ITGAM、ITGB2、TNFSFR21、RGS19和IAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11分別在趨勢(shì)21和趨勢(shì)23中具有重要作用。
(3)LDOC1基因可能在膽
6、道閉鎖發(fā)病過(guò)程中起著核心調(diào)控作用。
第二部分膽道閉鎖關(guān)鍵致病基因的表達(dá)及突變研究
目的:研究第一部分實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的膽道閉鎖中關(guān)鍵基因的表達(dá)及突變情況,以驗(yàn)證基因芯片結(jié)果并進(jìn)一步揭示該病的發(fā)病機(jī)制。
材料與方法:
(1)22例膽道閉鎖患兒和14例膽總管囊腫患兒手術(shù)活檢肝臟標(biāo)本,利用RT-PCR方法對(duì)趨勢(shì)21和趨勢(shì)23所發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵基因ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RSGl9和LAMC1、LA
7、MA5、MMP7、TIMP2、MMP11進(jìn)行了半定量檢測(cè)。同時(shí)以Real-time PCR的方法對(duì)LDOC1基因進(jìn)行了定量檢測(cè)。
(2)抽取10例膽道閉鎖患兒外周靜脈血2ML,抽提基因組DNA,對(duì)目的基因ITGB2和LDOC1基因外顯子進(jìn)行擴(kuò)增純化并測(cè)序,了解其突變及SNP改變情況。
結(jié)果:
(1)膽道閉鎖肝臟組織中ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RSGl9、LAMC1、LAMA5、MMP7、TI
8、MP2、MMP11及LDOC1均較膽總管囊腫明顯升高(P<0.05)。
(2)對(duì)ITGB2基因16個(gè)外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與NCBI參考序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn):9例患兒(9/10)存在ITGB2基因單核苷酸多態(tài)性改變。這些改變包括3個(gè)突變和11個(gè)SNP改變。其中突變分別是N212Y(2/10),Y544H(1/10),P752S(4/10);SNP改變包括:-156T/C(5/10),117G/A(1/10),
9、919G/A(5/10),1101C/A(4/10),1533C/T(1/10),3’-UTR+123C/T(4/10),3’-UTR+140G/A(4/10)。3’-UTR+148C/A(6/10),3’-UTR+170C/T(8/10),3’-UTR+219T/C(1/10),3’-UTR+286C/T(3/10)。LDOC1基因僅有1個(gè)外顯子,與參考序列相比,在3例患兒(3/10)存在單核苷酸多態(tài)性改變。共有1處SNP改變,為3’
10、-UTR+822C/T。
結(jié)論
(1)膽道閉鎖中,ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RGS19、LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11、LDOC1等關(guān)鍵基因表達(dá)升高,這些基因的功能主要涉及免疫炎癥及細(xì)胞外基質(zhì)重建,說(shuō)明它們可能參與膽道閉鎖炎癥及纖維化的進(jìn)程。
(2)膽道閉鎖中ITGB2基因外顯子區(qū)存在多處突變及單核苷酸改變。LDOC1基因外顯子區(qū)存在1處SNP改變。這些突變可能導(dǎo)致
11、相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)及功能改變,從而參與膽道閉鎖的發(fā)病。而SNP改變的存在,可能與膽道閉鎖的疾病易感性相關(guān)。
第三部分關(guān)鍵致病基因LDOC1對(duì)T淋巴細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響
目的:體外研究LDOC1基因高表達(dá)對(duì)T淋巴細(xì)胞Th1類炎癥因子表達(dá)的影響。
方法:體外構(gòu)建plRES2-EGFP-LDOC1質(zhì)粒,將pIRES2-EGFP-LDOC1和空白質(zhì)粒pIRES2-EGFP重組并包裝腺病毒,感染Jurkat細(xì)胞,利用west
12、ernblot的方法研究LDOC1蛋白的表達(dá),利用Elisa的方法研究無(wú)轉(zhuǎn)染組、pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組和Pad-IRES2-EGFP組細(xì)胞在靜息狀態(tài)和PMA激活狀態(tài)下Th1類炎癥因子TNF-α、IL-2、IFN-γ的表達(dá)情況。
結(jié)果:成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-LDOC1質(zhì)粒,并利用腺病毒包裝后轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞。轉(zhuǎn)染LDOC1組(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組)較陰性轉(zhuǎn)染組(Pad-IR
13、ES2-EGFP組),LDOC1蛋白表達(dá)明顯升高。轉(zhuǎn)染LDOC1組(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組)較陰性轉(zhuǎn)染組(Pad-IRES2-EGFP組),在靜息狀態(tài)下在炎癥因子產(chǎn)生上并無(wú)明顯差異,但在經(jīng)PMA刺激后,LDOC1組(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組)較陰性轉(zhuǎn)染組(Pad-IRES2-EGFP組)TNF-α、IL-2、IFN-γ的表達(dá)均明顯升高,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)具有顯著性差異(p值分別為0.0099、0.0043
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