WIF1在膽囊癌中恢復表達可抑制腫瘤生長并促進腫瘤細胞凋亡以及可調控EpCAM等蛋白質的表達.pdf

1、研究背景：
　　膽囊癌發(fā)病率在消化道惡性腫瘤中位居第五位,是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。早期診斷、早期治療是目前唯一治愈膽囊癌的有效手段,但是多數(shù)患者就醫(yī)時,已處于晚期,無法接受手術。影響膽囊癌患者預后的主要原因有膽囊癌發(fā)展迅速,易侵犯周圍臟器發(fā)生轉移等。因此對膽囊癌生長侵襲轉移機制方面的研究,尋找控制膽囊癌侵襲轉移的治療方法對提高膽囊癌患者生存期具有重要意義。
　　Wnt信號通路作為體內高度保守的代謝通路,廣泛參與了胚胎分化

2、,細胞增殖等總要過程,正常細胞內此通路一般處于關閉狀態(tài),而它的異常激活,往往與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關。以往的研究表明部分腫瘤中,WIF-1作為Wnt代謝通路的抑制因子之一,可通過阻斷Wnt通路從而抑制腫瘤的生長。但是WIF-1在膽囊癌中的表達情況以及對于膽囊癌的生物學行為的影響以及其作用機制目前仍尚無報道。
　　本研究在相關前期文獻報導的基礎上首次探討WIF-1基因在膽囊癌的表達及其臨床、病理和預后意義;研究其在膽囊癌增殖、侵襲、轉移

3、等過程中的作用;構建裸鼠膽囊癌原位移植瘤模型;研究WIF-1對于Wnt代謝通路蛋白質表達及膽囊癌細胞超微結構的影響。從而深化對膽囊癌發(fā)病和進展機制的了解,探索膽囊癌新的治療靶點。
　　第一部分:WIF-1在膽囊癌中的表達及其臨床病理和預后意義
　　目的:本研究旨在探討WIF-1的表達與膽囊癌的臨床病理特點及預后的關系。
　　方法:用免疫組化評價WIF-1蛋白在40例膽囊癌以及45例慢性膽囊炎中的表達情況,結合臨床數(shù)據(jù)進

4、行分析。采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料采用χ2檢驗,WIF-1表達與臨床病理學特征的關系用四格表確切概率法,P<0.05視為有統(tǒng)計學意義。
　　結果:WIF-1在40例膽囊癌標本中,僅9例WIF-1表達陽性,表達率為22.5％(9/40),而在45例膽囊炎中,WIF1的表達率為100%(45/45),兩者之間的陽性率具有顯著差異性(P<0.001)。膽囊癌組織中WIF-1基因表達與年齡、性別、腫瘤大小、有無伴有膽

5、囊結石、組織學類型、分化程度等臨床病理學資料均未見相關性(P>0.05),提示WIF-1的缺失表達可能是膽囊癌發(fā)生過程中的早期事件。
　　第二部分:WIF-1基因在膽囊癌細胞中表達情況及WIF-1過表達膽囊癌細胞株的構建鑒定
　　目的:檢測WIF-1在三株膽囊癌細胞系中的表達情況并初步探討造成這種情況的原因:進而構建過表達WIF-1膽囊癌GBC-SD細胞株,并對其進行檢測WIF-1mRNA和蛋白質表達變化情況。
　　方

6、法:采用RTPCR、Western-Blot、啟動子甲基化特異性PCR技術分析GBC-SD、NOZ以及SGC-996三株細胞WIF-1mRNA、WIF-1蛋白及WIF-1基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài);并通過質粒轉染膽囊癌細胞系GBC-SD,應用RT-PCR及Weatern-Blot技術檢測轉染后人膽囊癌細胞GBC-SD的WIF-1的mRNA及蛋白表達。
　　結果:GBC-SD、NOZ、SGC-996細胞系中WIF-1均缺失表達,三株細

7、胞中WIF-1啟動子區(qū)域均存在甲基化狀況,這可能是造成WIF-1在三株細胞中缺失表達的原因。過表達WIF-1質粒作用于人膽囊癌細胞株GBC-SD后,WIF-1的mRNA表達恢復,WIF-1蛋白表達恢復。
　　第三部分:過表達WIF-1基因對人膽囊癌細胞增殖、侵襲、轉移及凋亡能力的影響
　　目的:研究過表達WIF-1基因對人膽囊癌細胞增殖、侵襲、轉移及凋亡能力的影響。
　　方法:膽囊癌GBC-SD細胞分為三組:GBC-S

8、D未處理組,GBC-SD空質粒組(GBC-SD-MOCK)以及GBC-SD過表達組(GBC-SD-WIF-1)。CCK-8法檢測三組細胞增殖能力;Transwell小室運動侵襲試驗檢測細胞遷移和侵襲能力;流式細胞儀檢測WIF-1誘導腫瘤細胞凋亡能力;明膠酶譜法檢測細胞上清MMPs分泌變化情況。
　　結果:過表達WIF-1基因能抑制GBC-SD細胞增殖、遷移及侵襲,并可促進GBC-SD細胞凋亡(P<0.01)。空質粒組及未處理組細胞

9、間增殖、侵襲、轉移凋亡能力無明顯差異(P>0.05)。過表達WIF-1能抑制MMP-2及MMP-9的分泌(P<0.01),GBC-SD-MOCK組及GBC-SD組分泌MMP2,9能力無明顯差異(P>0.05)。
　　第四部分:過表達WIF-1基因對人膽囊癌細胞裸鼠皮下移植瘤侵襲和轉移的影響
　　目的:研究過表達WIF-1基因對人膽囊癌細胞裸鼠皮下移植瘤生長侵襲的影響。
　　方法:膽囊癌GBC-SD細胞分為三組:GBC-

10、SD未處理組,GBC-SD空質粒組(GBC-SD-MOCK)以及GBC-SD過表達組(GBC-SD-WIF-1),15只裸鼠隨機分為3組,每組5只。收集對數(shù)生長期的三組細胞,注射100μl,1×106細胞/鼠細胞懸液于實驗裸鼠左前腋皮下,觀察五周后處死裸鼠,測量稱重體積,收集標本制做病理切片。
　　結果:3組裸鼠成瘤率100%,過表達WIF-1組裸鼠腫瘤生長速度及成瘤體積重量均明顯小于其余2組(P<0.001);空質粒組及未處理陰

11、性組成瘤無明顯差異(P>0.05);三組細胞成瘤均未見腹腔轉移及肝臟轉移,表明過表達WIF-1基因抑制人膽囊癌細胞在裸鼠體內生長轉移。
　　第五部分過表達WIF-1對于下游蛋白質的調控以及細胞微觀結構的影響
　　目的:研究過表達WIF-1對于GBC-SD細胞內蛋白質表達的影響,分析WIF-1對于WNT代謝通路的作用機制及觀察過表達WIF-1蛋白的GBC-SD細胞系超微結構變化。
　　方法:采用Raybiotech蛋白芯

12、片半定量檢查過表達WIF-1蛋白的GBC-SD細胞系內部分蛋白質表達變化;采用掃描電鏡觀察其GBC-SD-WIF-1、GBC-SD-MOCK、GBC-SD三株細胞超微結構變化。
　　結果:WIF-1可導致EpCAM等多種蛋白質的表達發(fā)生上調或下降,這些蛋白質參與了細胞內諸多重要生理病理過程,提示WIF-1可能通過調節(jié)這些蛋白質的表達而參與了腫瘤細胞上皮間質化過程;掃描電鏡結果提示GBC-SD-WIF-1細胞內溶酶體分泌顯著增多,而

13、GBC-SD細胞與GBC-SD-MOCK細胞內則未見這一變化。
　　結論：
　　1、多數(shù)膽囊癌組織中缺失表達WIF-1,WIF-1表達情況與腫瘤大小、分化程度和TNM分期無明顯相關,表明WIF-1的失活可能為膽囊癌發(fā)生發(fā)展過程中的早期事件。
　　2、膽囊癌細胞系GBC-SD、NOZ-996及SGC-996三株細胞系中WIF-1 mRNA均缺失表達,不表達WIF-1蛋白,這可能與其啟動子區(qū)域存在甲基化相關;構建過表達WI

14、F-1質粒作用于人膽囊癌細胞株GBC-SD后,WIF-1 mRNA表達恢復,WIF-1蛋白表達恢復。
　　3、過表達WIF-1基因能抑制GBC-SD細胞增殖、遷移及侵襲能力,并可促進GBC-SD細胞凋亡,與之相對應MMP2,9在過表達WIF-1蛋白GBC-SD細胞中表達降低,證明了WIF-1對于GBC-SD的侵襲轉移具有抑制效應可能與MMPs分泌相關。
　　4、人膽囊癌細胞GBC-SD皮下接種裸鼠可產生移植瘤;過表達WIF-