骨髓源神經(jīng)干細胞聯(lián)合基質(zhì)膠修復大鼠腦損傷及動態(tài)MEMRI成像大鼠視皮層實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 隨著社會的不斷發(fā)展,交通設施更為發(fā)達,機動車輛增多,施工工地和工廠多,所導致的交通事故和工傷相應增加,創(chuàng)傷傷員逐年增多。在這些創(chuàng)傷中,顱腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)的發(fā)生率較高,并且是創(chuàng)傷致死因為中的首要因素,在存活病例中,其致殘率也較高,給患者帶來極大的痛苦,也給社會和患者家人帶來負擔。盡管在顱腦損傷的院前救護、影像學技術、危重癥急救和康復鍛煉等臨床技術方面已經(jīng)有了顯著的進步

2、,但治療的目的僅在于盡可能保存殘留的神經(jīng)功能,降低致死致殘率,而對于已經(jīng)發(fā)生的神經(jīng)損害尚無有效的治療手段。如何促進顱腦損傷后神經(jīng)再生和神經(jīng)功能恢復是當前研究的熱點及難點。TBI后修復面臨的主要問題是:原發(fā)性和繼發(fā)性的神經(jīng)元的缺失,以及受損部位周圍的局部微環(huán)境存在一些不利于軸突再生的因素,主要有髓鞘相關軸突生長抑制因子(Nogo-A、MAG、Omgp等)、炎癥反應、細胞外基質(zhì)(ECM)改變、膠質(zhì)瘢痕的形成等,因此治療腦損傷的策略之一在于補

3、充缺失的神經(jīng)元,改善損傷局部的微環(huán)境。雖然大量的實驗已經(jīng)表明,無論是在成年還是未成年的動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerve system,CNS)內(nèi)都有神經(jīng)干細胞(neural stemcells,NSCs)的存在,這類細胞群能自我更新,并且具有分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的能力,在一定條件下可以進行增殖、遷移和分化,在一定的程度上參與修復缺損的神經(jīng)功能,但是在成體中樞神經(jīng)損傷后此類細胞再生能力有限,遠遠不能完成神經(jīng)功能再生修復的

4、功能,特別是大面積受損的中樞神經(jīng)組織,僅靠自身的神經(jīng)干細胞修復是無法實現(xiàn)的。隨著干細胞研究的不斷進步,已經(jīng)有大量的研究通過自體或者異體移植不同的干細胞(包括不同來源的成體間充質(zhì)干細胞和胚胎干細胞等)而取得了一些令人振奮的效果,所以干細胞移植治療顱腦創(chuàng)傷后中樞神經(jīng)功能缺損為我們帶來了新的希望。在種子細胞來源方面,骨髓基質(zhì)細胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)來源豐富易獲取,有研究表明成人骨髓基質(zhì)細胞在體外可

5、快速有效地誘導分化成為成人骨髓源性神經(jīng)干細胞(human adult bone marrow-derived neural stem cells,MDNSCs),而且成人骨髓源性神經(jīng)干細胞具有和自身腦源性的神經(jīng)干細胞相似的生物學特征,如果應用于患者自身移植,避免了可能的免疫排斥反應,并且沒有倫理爭議。除了要解決種子細胞的問題外,還要改善損傷局部的微環(huán)境,使其適于神經(jīng)組織的修復,同時移植入外源性細胞替代失去功能或死亡的細胞,并與宿主細胞形

6、成具有功能的整合,改善神經(jīng)功能缺陷。組織工程支架材料的發(fā)展為解決這一問題帶來了希望,支架材料類似于細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,提供種子細胞粘附的支架,在代替細胞外基質(zhì)方面起著重要的作用,目前研究的神經(jīng)組織工程支架材料主要有:天然生物材料、合成材料、化學修飾材料、復合材料、生物衍生材料及納米材料等。鑒于以上因素,本實驗選用骨髓基質(zhì)細胞誘導得到的神經(jīng)干細胞作為種子細胞與作為支架材料的基質(zhì)膠(BD Biosciences,Matrigel)聯(lián)合移

7、植來觀察對腦損傷的修復作用。
　　 種子細胞來源的不斷豐富和組織工程支架材料的不斷改進,推動干細胞移植療法的發(fā)展,但是在應用干細胞療法之前我們有很多問題需要解決,其中如何通過非侵入性的方法對干細胞在體內(nèi)的遷移分化和功能情況等進行監(jiān)測和評估就是其中之一,因為移植細胞和宿主細胞之間的相互作用和功能聯(lián)系的機制還不甚清楚,而這些是我們把干細胞移植療法應用于臨床之前需要解決的問題,一種有效的非侵入性的評估干細胞移植療法的方法對于我們制定臨

8、床策略和評價預后同樣重要。在現(xiàn)有的多種方法中,神經(jīng)影像學用于活體示蹤是目前研究最熱門的方法之一,主要包括磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)技術,核醫(yī)學技術,熒光和生物發(fā)光技術等。通過縱向長期評價,而不需要處死動物,活體示蹤能夠更好的研究移植后細胞的遷移和移植細胞發(fā)揮作用的機制,這些不僅對于發(fā)展干細胞療法有促進作用而且對于將來的臨床應用有更大的實用價值。
　　 目前國內(nèi)外的研究多是從結(jié)構(gòu)上活

9、體示蹤移植干細胞的存活和遷移,如SPIO(Superparamagnetic iron oxide,SPIO)的應用等,但這些標記物結(jié)合影像學活體示蹤無法從功能上追蹤移植細胞在宿主神經(jīng)組織內(nèi)的功能狀態(tài),所以我們需要從功能上評估和示蹤移植干細胞與宿主組織的功能整合。在功能成像研究方面,以往采用的FDG PET(F-fluoro-deoxy-D-glucose PET)及BOLD MRI(blood oxygenationlevel dep

10、endent MRI)方法只可提供區(qū)域腦組織活動的間接指標信息-腦局部糖代謝變化,尚難以直接反映神經(jīng)功能活動變化,特別是尚無法在細胞水平上直接反映移植干細胞的功能活動。由此本實驗組考慮應用活性誘導錳離子增強磁共振技術進行神經(jīng)干細胞移植后功能恢復評估的前期研究。
　　 錳離子增強磁共振成像(manganese-enhanced MRI,MEMRI)技術,是一種功能磁共振成像技術。1997年,Lin YJ and Koretsky

11、AP首次應用該技術進行大鼠電刺激前肢后腦功能成像,并闡述了MEMRI功能成像的原理:利用神經(jīng)細胞發(fā)生電活動時電壓依賴性鈣離子通道開放,而錳離子作為鈣離子的類似物、可以通過開放的電壓依賴性鈣離子通道進入細胞,加之錳離子是一種順磁性物質(zhì),從而可以起到標記發(fā)生電活動的神經(jīng)細胞的作用,使這些激活的區(qū)域獲得磁共振增強效果,這基于其可以通過開放的電壓依賴性鈣離子通道進入神經(jīng)細胞及在局部用藥時可以沿神經(jīng)束順行傳遞這兩方面特性,而且錳離子在神經(jīng)功能活動

12、發(fā)生時迅速進入激活的神經(jīng)元后,在細胞內(nèi)的清除期較長,錳離子可以在激活的神經(jīng)元中持續(xù)增加聚集,這種錳離子顯像時程累積效應將有助于從數(shù)以千萬計的移植細胞中捕捉到更細微、更瞬時的神經(jīng)元電活動,其既往應用主要包括神經(jīng)功能成像、神經(jīng)束成像和腦構(gòu)筑成像等研究,近期也將其應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病成像。
　　 鑒于大鼠視覺系統(tǒng)功能和解剖的確定性,以及國內(nèi)外鮮見應用錳離子增強成像技術功能成像大鼠視覺皮層的研究,本實驗中第二部分選擇了視覺皮層為研究對象,

13、嘗試應用動態(tài)成像方法示蹤大鼠視覺皮層的功能活動,為神經(jīng)系統(tǒng)功能研究提供方法學上的支持。
　　 第一部分:骨髓源性神經(jīng)干細胞聯(lián)合基質(zhì)膠對大鼠腦損傷的治療作用
　　 目的：目前在修復腦損傷的研究中,關于干細胞和組織工程材料聯(lián)合移植修復腦損傷的研究較少,尚鮮見有骨髓源性神經(jīng)干細胞聯(lián)合基質(zhì)膠(Matrigel)修復腦損傷的研究,本實驗主要探討胞,并用bFGF、EGF和N2等誘導成骨髓源性神經(jīng)干細胞,然后用熒光染劑DiI標記后移植

14、。32只Wistar大鼠,隨機分為4組:正常組,生理鹽水組,單純BMSC-D-NSCs移植組,BMSC-D-NSCs聯(lián)合基質(zhì)膠移植組。采用改良自由落體撞擊腦損傷模型,損傷7天后采用損傷區(qū)移植,分別于細胞移植后1、7、14、21、28天進行動物行為學評分,移植4周后處死實驗動物,相關組織學染色后,計算損傷所致空腔體積,分析移植細胞的存活和遷移情況,數(shù)據(jù)資料應用SPSS13.0軟件進行分析,各組治療后的體積比較采用單向方差分析；不同處理組在

15、五個時間點的行為學評分采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析進行統(tǒng)計分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論:BMSC-D-NSCs聯(lián)合Matrigel移植組比單純BMSC-D-NSCs移植組能更好的促進腦損傷的修復。
　　 第二部分:動態(tài)錳離子增強磁共振功能成像大鼠視覺皮層
　　 目的：雖然我們的前期研究表明,BMSC-D-NSCs聯(lián)合Matrigel移植組比單純BMSC-D-NSCs移植組能更好的促進神經(jīng)功能

16、恢復,但其在活體的功能情況仍不明了,本課題組擬采用動態(tài)MEMRI功能成像來研究BMSC-D-NSCs移植后在體內(nèi)的功能情況,我們首先進行了一些成像方法上的初步研究,本部分用動態(tài)錳離子增強磁共振技術行大鼠視覺皮層功能成像,為神經(jīng)系統(tǒng)功能研究提供方法學上的參考。
　　 方法:成年雄性Wistar大鼠6只,右頸外動脈插管后于連續(xù)的4個時段分別進行不同的處理,第一時段(5min)成像前不給予藥物處理,無視覺刺激；第二時段(10min)成

17、像前經(jīng)右頸內(nèi)動脈應用甘露醇開放血腦屏障和注射氯化錳,無視覺刺激；第三時段(15min)成像前僅給與氯化錳注射,給予視覺刺激；第四時段(5min)成像前注射氯化錳與谷氨酸混合液,無視覺刺激；每一時段處理后立即進行大鼠頭顱磁共振成像,應用SPM軟件進行圖像的配準和平滑處理,應用Matlab軟件得出圖像的配色圖及等高線圖；選取視覺皮層進行興趣區(qū)(Regions of interest,ROI)分析,觀察不同處理后磁共振中腦內(nèi)特異性增強區(qū)域并比

18、較大鼠視覺皮層的信號強度,數(shù)據(jù)資料統(tǒng)計分析用SPSS13.0軟件進行,應用配對t檢驗比較第二階段和第三階段的差異。
　　 結(jié)果:磁共振圖像分析顯示第一、二時段大鼠腦內(nèi)未發(fā)現(xiàn)特異性增強區(qū)域,第三時段大鼠右側(cè)視覺皮層特異性增強,第四時段大鼠右側(cè)腦內(nèi)多個核團特異性增強；ROI 分析顯示第三時段處理后的視覺皮層信號強度(1.897±0.172)明顯強于第二時段(1.549±0.163),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。