骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與雪旺細(xì)胞聯(lián)合移植治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：細(xì)胞移植策略是治療脊髓損傷的重要內(nèi)容,是該領(lǐng)域的熱門(mén)研究方向。其作用機(jī)制在于通過(guò)細(xì)胞移植,一方面在損傷局部起到細(xì)胞替代作用,挽救殘存的細(xì)胞,爭(zhēng)取最大化結(jié)構(gòu)上的重建,另一方面改變損傷局部不利再生的微環(huán)境,創(chuàng)造有利于修復(fù)的條件,從而促進(jìn)功能的恢復(fù)。單一細(xì)胞移植明顯不能同時(shí)兼顧各個(gè)方面,因此目前其修復(fù)脊髓損傷的效果不能令人滿意。
　　 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和雪旺細(xì)胞作為脊髓組織工程學(xué)的兩個(gè)重要的種子細(xì)胞,均可進(jìn)行自體移植,具有一定優(yōu)勢(shì)

2、。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察二者共培養(yǎng)是否促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)二者聯(lián)合移植能否促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的遷移。并在此兩次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上聯(lián)合移植,修復(fù)大鼠脊髓半橫切損傷模型,通過(guò)術(shù)后形態(tài)學(xué)和功能學(xué)上的檢測(cè),探討其可行性及優(yōu)勢(shì)。
　　 方法：
　　 一、細(xì)胞培養(yǎng):
　　 1、大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng):采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),CD44,CD45免疫熒光鑒定,傳3代,調(diào)節(jié)細(xì)胞終濃度1×10

3、5/uL備用,每次實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)用BrdU(10umol/L)標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2、大鼠雪旺細(xì)胞的培養(yǎng):取大鼠坐骨神經(jīng)采用混合酶消化法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),S-100蛋白免疫熒光鑒定,傳3代,調(diào)節(jié)細(xì)胞終濃度1×105/uL備用。
　　 二、大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和雪旺細(xì)胞體外共培養(yǎng),觀察雪旺細(xì)胞能否促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化
　　 1、實(shí)驗(yàn)步驟共培養(yǎng)組:1×105/ml雪旺細(xì)胞與1×105/ml骨髓基質(zhì)干

4、細(xì)胞(Brdu標(biāo)記)各以100ul/孔(1×104個(gè))接種到明膠包被的蓋玻片上,再加入1ml DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞完全貼壁后,每3天換液一次。對(duì)照組:同樣方法做單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)。
　　 2、結(jié)果檢測(cè)：共培養(yǎng)2周后,觀察兩種細(xì)胞生長(zhǎng)情況,測(cè)量細(xì)胞集落細(xì)長(zhǎng)狀突起的長(zhǎng)度,用BrdU和神經(jīng)元特異性烯醇化酶免疫熒光顯色,統(tǒng)計(jì)神經(jīng)元樣細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量并計(jì)算骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化率。
　　 三、動(dòng)

5、物實(shí)驗(yàn)觀察雪旺細(xì)胞對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞遷移的影響：
　　 1、實(shí)驗(yàn)步驟
　　 (1)制作T10右側(cè)脊髓半橫切模型。
　　 (2)實(shí)驗(yàn)組:20只,損傷后立即行骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和雪旺細(xì)胞聯(lián)合移植,移植細(xì)胞數(shù)量為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞1×106個(gè)/只,雪旺細(xì)胞1×106個(gè)/只。對(duì)照組:20只,損傷后立即行單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植,移植細(xì)胞數(shù)量為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞1×106個(gè)/只。
　　 2、結(jié)果檢測(cè)：術(shù)后4周,無(wú)痛苦處死動(dòng)物,取材

6、,固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,免疫組化染色檢測(cè)BrdU,觀察各組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)遷移距離及移植后在脊髓損傷附近分布情況。
　　 四、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：聯(lián)合移植后,觀察組織形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的變化
　　 1、實(shí)驗(yàn)步驟
　　 (1)制作T10右側(cè)脊髓半橫切模型。
　　 (2)實(shí)驗(yàn)組A:20只,骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和雪旺細(xì)胞聯(lián)合移植,移植細(xì)胞數(shù)量為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞1×106個(gè)/只,雪旺細(xì)胞1×106個(gè)/只。實(shí)驗(yàn)組B:20只,骨髓基

7、質(zhì)干細(xì)胞移植,移植細(xì)胞數(shù)量為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞1×106個(gè)/只。對(duì)照組:20只,注射PBS。
　　 2、結(jié)果檢測(cè)
　　 (1)形態(tài)學(xué)檢測(cè)：術(shù)后4周,麻醉后,取材,固定,光鏡觀察損傷區(qū)囊性病變面積,通過(guò)神經(jīng)元特異性烯醇化酶,生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43,髓鞘堿性蛋白免疫組化檢測(cè)神經(jīng)元、軸突生長(zhǎng)錐及髓鞘再生情況。
　　 (2)功能學(xué)檢測(cè): 術(shù)后4周,斜板實(shí)驗(yàn)觀測(cè)斜板角度,爬網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)觀察后肢運(yùn)動(dòng)與協(xié)調(diào)情況,并通過(guò)神經(jīng)電生理檢測(cè)誘發(fā)電位

8、波幅和潛伏期。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,SPSSll.5統(tǒng)計(jì)軟件分析檢驗(yàn),P＜0.01表示有顯著差異,P＞0.05表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 一、細(xì)胞培養(yǎng)：成功進(jìn)行了雪旺細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代,骨髓基質(zhì)干細(xì)胞免疫熒光鑒定CD45(-),CD44(+),并用BrdU標(biāo)記。雪旺細(xì)胞S-100蛋白免疫熒光鑒定(+)。
　　 二、體外實(shí)驗(yàn)：共培養(yǎng)明顯促進(jìn)骨

9、髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化
　　 1、鏡下觀察共存良好兩周后,鏡下觀察雪旺細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞共存良好,相互親和,骨髓基質(zhì)干細(xì)胞形成球狀集落,發(fā)出突起呈放射狀伸展,雪旺細(xì)胞沿骨髓基質(zhì)干細(xì)胞集落發(fā)出的突起呈放射狀分布,形成類(lèi)似海星狀排列。
　　 2、共培養(yǎng)促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化神經(jīng)元特異性烯醇化酶和BrdU熒光染色結(jié)果顯示共培養(yǎng)組向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化率明顯高于單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)組。共培養(yǎng)組神經(jīng)元樣細(xì)胞分化

10、率(％)80.51±5.65,單純骨萌基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)組分化率(％)58.99±6.62,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P＜0.01,有顯著差異。
　　 三、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察雪旺細(xì)胞明顯促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)的遷移
　　 1、鏡下觀察遷移情況BrdU免疫組化鏡下觀察:可見(jiàn)脊髓標(biāo)本內(nèi),BrdU標(biāo)記陽(yáng)性的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞存活,核呈棕黃色,沿著脊髓灰白質(zhì)交界處有序遷移。移植細(xì)胞分布:陽(yáng)性細(xì)胞主要聚集在損傷附近,隨著與損傷區(qū)的距離增加,陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少,

11、經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間比較有顯著差異,P＜0.01。而組內(nèi)損傷區(qū)頭、尾側(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量基本對(duì)稱分布,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)差異,P＞0.05。
　　 2、遷移距離檢測(cè)聯(lián)合移植組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞平均遷移距離1.83±0.13cm,可最遠(yuǎn)達(dá)2.0cm。單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植組平均遷移距離1.38±0.51cm,最遠(yuǎn)達(dá)1-5cm。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間比較P＜0.01,有顯著差異。
　　 四、聯(lián)合移植明顯促進(jìn)了脊髓損傷后組織形態(tài)和功能的恢復(fù)
　　

12、 (一)形態(tài)學(xué)檢測(cè)(術(shù)后4周)
　　 1、損傷區(qū)囊變病灶檢測(cè)經(jīng)圖像分析系統(tǒng)分析所測(cè)損傷區(qū)囊變面積的像素值以聯(lián)合移植組囊變范圍最小,與單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植組比較,P＜0.01,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2、神經(jīng)元、生長(zhǎng)錐、髓鞘免疫組化檢測(cè)通過(guò)神經(jīng)元特異性烯醇化酶,生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43,髓鞘堿性蛋白免疫組化染色,檢測(cè)損傷區(qū)局部神經(jīng)元,軸突生長(zhǎng)錐及髓鞘再生數(shù)量,聯(lián)合細(xì)胞移植組要明顯優(yōu)于單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植組,而PBS對(duì)照組最

13、差,方差分析P＜0.01,差異顯著。
　　 (二)功能學(xué)檢測(cè)(術(shù)后4周)
　　 1、斜板實(shí)驗(yàn)及爬網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)斜板實(shí)驗(yàn)顯示:聯(lián)合移植組動(dòng)物斜板角度大于單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植組,P＜0.01。網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)顯示聯(lián)合移植組動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)與協(xié)調(diào)性恢復(fù)最佳,優(yōu)于單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植組,PBS對(duì)照組組最差。
　　 2、神經(jīng)電生理檢測(cè)誘發(fā)電位波幅:由高到低順序?yàn)槁?lián)合移植組,單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植組,PBS對(duì)照組。潛伏期:由快到慢為聯(lián)合移

14、植組,單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植組,PBS對(duì)照組。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間比較,P＜0.01,有顯著差異。
　　 討論：脊髓損傷后,局部神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的原發(fā)及繼發(fā)性的丟失,囊性病變,膠質(zhì)瘢痕的形成,中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在的各種抑制再生因素,加上中樞神經(jīng)自身極差的再生能力,這些因素造成了脊髓損傷后結(jié)構(gòu)和功能上的嚴(yán)重破壞,傳統(tǒng)的藥物及手術(shù)治療效果非常不理想。目前,脊髓損傷仍是醫(yī)學(xué)界未能攻克的難題,細(xì)胞移植作為治療策略之一,從理論上能夠更好地治療脊髓

15、損傷,即通過(guò)細(xì)胞移植,可以補(bǔ)充丟失的神經(jīng)元細(xì)胞,使植入的細(xì)胞與殘存的神經(jīng)元相突觸,起到上下傳導(dǎo)中繼作用,并能分泌有利神經(jīng)再生的因子,改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部不利再生的微環(huán)境,從而促進(jìn)結(jié)構(gòu)再生,達(dá)到更好的功能恢復(fù)。用于研究脊髓損傷的移植細(xì)胞包括:干細(xì)胞主要有神經(jīng)干細(xì)胞(NSC),胚胎干細(xì)胞(ESC),骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),非干細(xì)胞主要有雪旺細(xì)胞(Sc),嗅鞘細(xì)胞(OECs),巨噬細(xì)胞等。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞作為一種多潛能干細(xì)胞,具有其它細(xì)胞

16、無(wú)以比擬的優(yōu)勢(shì),獲取方便,來(lái)源豐富,不涉及倫理道德問(wèn)題,在宿主組織中可長(zhǎng)期存活并整合,可自體移植,無(wú)免疫排斥的問(wèn)題,體外培養(yǎng)擴(kuò)增快速,能定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,并經(jīng)大量試驗(yàn)已證明骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷具有良好的效果,是目前比較理想的移植細(xì)胞。而雪旺細(xì)胞是包繞于周?chē)窠?jīng)特有的膠質(zhì)細(xì)胞,眾所周知,周?chē)窠?jīng)能夠再生,它的支持和保護(hù)營(yíng)養(yǎng)作用是至關(guān)重要的。由此人們自然想到了將周?chē)窠?jīng)的支持保護(hù)細(xì)胞雪旺細(xì)胞引入中樞,修復(fù)中樞神

17、經(jīng)損傷,取得了一定的療效。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用體外試驗(yàn)將兩種細(xì)胞共培養(yǎng),證實(shí)兩種細(xì)胞能完全共存,并且互相吸引,相互支持,在雪旺細(xì)胞存在下,能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞更多地向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。遷移結(jié)果顯示骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在雪旺細(xì)胞支持下能夠?qū)崿F(xiàn)更遠(yuǎn)的遷移。動(dòng)物試驗(yàn)將兩種細(xì)胞聯(lián)合移植,利用雪旺細(xì)胞分泌各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)物質(zhì),并誘導(dǎo)神經(jīng)元的生長(zhǎng)錐生成,延長(zhǎng),還可抑制膠質(zhì)瘢痕形成等特性,發(fā)揮其能營(yíng)造有利神經(jīng)再生的微環(huán)境和促進(jìn)損傷神經(jīng)元的存活及軸突再生

18、的優(yōu)勢(shì),結(jié)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有多分化潛能,在植入脊髓損傷區(qū)后可以補(bǔ)充缺失的神經(jīng)元,從而達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),更好地促進(jìn)脊髓損傷后功能恢復(fù)。經(jīng)手術(shù)后行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)聯(lián)合移植組大鼠癱瘓右下肢能夠較好地恢復(fù),爬網(wǎng)格試驗(yàn)顯示聯(lián)合組能用右后肢蹬踩網(wǎng)格,可攀爬陡峭網(wǎng)格,足底可暫負(fù)重行走,后肢運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)好。而單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植上述情況明顯不及聯(lián)合移植組。斜板試驗(yàn)測(cè)得角度比較,亦證實(shí)聯(lián)合移植恢復(fù)最好。脊髓損傷后由原發(fā)創(chuàng)傷及繼發(fā)損傷造成局部神經(jīng)組織壞死,形成囊腔

19、,以后為瘢痕組織占據(jù),并產(chǎn)生抑制因子阻礙神經(jīng)纖維穿過(guò),通過(guò)鏡下觀察見(jiàn)聯(lián)合移植組囊腔面積較對(duì)照組明顯減小,圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)并經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析也證實(shí)所測(cè)囊腔面積比較,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說(shuō)明細(xì)胞聯(lián)合移植后,移植細(xì)胞與宿主組織整合良好,可填充囊性區(qū),最大拯救了神經(jīng)壞死區(qū),有效抑制了囊性變和瘢痕組織形成,為神經(jīng)再生提供了結(jié)構(gòu)上的重建。神經(jīng)元特異性烯醇化酶、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43和髓鞘堿性蛋白免疫組化顯示實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元細(xì)胞、軸突生長(zhǎng)錐和髓鞘數(shù)量明

20、顯高于單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞組,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著差異(P＜0.01)?？紤]一方面是移植的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,起到了局部細(xì)胞替代作用,另一方面是雪旺細(xì)胞分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)殘存的細(xì)胞起到了最大保護(hù)作用,減少了繼發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞死亡,同時(shí)其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞粘附分子等促突起分子促進(jìn)了軸突的再生,其自身促進(jìn)髓鞘再生功能更是得到了體現(xiàn)。神經(jīng)電生理檢測(cè),誘發(fā)電位波幅及潛伏期以聯(lián)合細(xì)胞移植組最佳。說(shuō)明一方面移植的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與周?chē)?/p>

21、經(jīng)組織形成突觸,起到了神經(jīng)傳導(dǎo)中繼站的作用,另一方面是雪旺細(xì)胞明顯促神經(jīng)纖維髓鞘再生的作用所致,改善了傳導(dǎo)束結(jié)構(gòu),從而使興奮的傳導(dǎo)更快捷、明顯?？傊?本實(shí)驗(yàn)采用兩種細(xì)胞聯(lián)合移植,使二者相互作用,充分發(fā)揮其各自生物學(xué)效應(yīng),如雪旺細(xì)胞分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素,保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞,并促進(jìn)髓鞘及軸突再生與修復(fù),而骨銹基質(zhì)干細(xì)胞又具有分化神經(jīng)元的潛能,這樣既補(bǔ)充了缺失的神經(jīng)元細(xì)胞,又促進(jìn)了軸突再生及神經(jīng)傳導(dǎo)束髓鞘化,抑制了不利神經(jīng)再生的各種因素,減少了膠質(zhì)瘢

22、痕和囊性病變,最大化達(dá)到了結(jié)構(gòu)上的重建,為功能重建打下組織學(xué)基礎(chǔ),從而更好的促進(jìn)了脊髓損傷的恢復(fù)。經(jīng)查閱文獻(xiàn)至今還未發(fā)現(xiàn)有關(guān)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和雪旺細(xì)胞聯(lián)合移植的實(shí)驗(yàn)研究,本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步治療脊髓損傷奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 結(jié)論：
　　 1、聯(lián)合移植促進(jìn)脊髓損傷后功能恢復(fù),與單純細(xì)胞移植比較,具有優(yōu)勢(shì)。
　　 2、聯(lián)合移植可促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)遷移。
　　 3、共培養(yǎng),雪旺細(xì)胞能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)