骨髓基質(zhì)干細胞與雪旺細胞聯(lián)合移植治療大鼠脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、目的：細胞移植策略是治療脊髓損傷的重要內(nèi)容,是該領域的熱門研究方向。其作用機制在于通過細胞移植,一方面在損傷局部起到細胞替代作用,挽救殘存的細胞,爭取最大化結構上的重建,另一方面改變損傷局部不利再生的微環(huán)境,創(chuàng)造有利于修復的條件,從而促進功能的恢復。單一細胞移植明顯不能同時兼顧各個方面,因此目前其修復脊髓損傷的效果不能令人滿意。
　　 骨髓基質(zhì)干細胞和雪旺細胞作為脊髓組織工程學的兩個重要的種子細胞,均可進行自體移植,具有一定優(yōu)勢

2、。本研究通過體外實驗觀察二者共培養(yǎng)是否促進骨髓基質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化,體內(nèi)實驗檢測二者聯(lián)合移植能否促進骨髓基質(zhì)干細胞在體內(nèi)的遷移。并在此兩次實驗基礎上聯(lián)合移植,修復大鼠脊髓半橫切損傷模型,通過術后形態(tài)學和功能學上的檢測,探討其可行性及優(yōu)勢。
　　 方法：
　　 一、細胞培養(yǎng):
　　 1、大鼠骨髓基質(zhì)干細胞的培養(yǎng):采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法進行細胞培養(yǎng),CD44,CD45免疫熒光鑒定,傳3代,調(diào)節(jié)細胞終濃度1×10

3、5/uL備用,每次實驗前24小時用BrdU(10umol/L)標記骨髓基質(zhì)干細胞。
　　 2、大鼠雪旺細胞的培養(yǎng):取大鼠坐骨神經(jīng)采用混合酶消化法進行細胞培養(yǎng),S-100蛋白免疫熒光鑒定,傳3代,調(diào)節(jié)細胞終濃度1×105/uL備用。
　　 二、大鼠骨髓基質(zhì)干細胞和雪旺細胞體外共培養(yǎng),觀察雪旺細胞能否促進骨髓基質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化
　　 1、實驗步驟共培養(yǎng)組:1×105/ml雪旺細胞與1×105/ml骨髓基質(zhì)干

4、細胞(Brdu標記)各以100ul/孔(1×104個)接種到明膠包被的蓋玻片上,再加入1ml DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細胞完全貼壁后,每3天換液一次。對照組:同樣方法做單純骨髓基質(zhì)干細胞培養(yǎng)。
　　 2、結果檢測：共培養(yǎng)2周后,觀察兩種細胞生長情況,測量細胞集落細長狀突起的長度,用BrdU和神經(jīng)元特異性烯醇化酶免疫熒光顯色,統(tǒng)計神經(jīng)元樣細胞和骨髓基質(zhì)干細胞數(shù)量并計算骨髓基質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化率。
　　 三、動

5、物實驗觀察雪旺細胞對骨髓基質(zhì)干細胞遷移的影響：
　　 1、實驗步驟
　　 (1)制作T10右側脊髓半橫切模型。
　　 (2)實驗組:20只,損傷后立即行骨髓基質(zhì)干細胞和雪旺細胞聯(lián)合移植,移植細胞數(shù)量為骨髓基質(zhì)干細胞1×106個/只,雪旺細胞1×106個/只。對照組:20只,損傷后立即行單純骨髓基質(zhì)干細胞移植,移植細胞數(shù)量為骨髓基質(zhì)干細胞1×106個/只。
　　 2、結果檢測：術后4周,無痛苦處死動物,取材

6、,固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,免疫組化染色檢測BrdU,觀察各組骨髓基質(zhì)干細胞體內(nèi)遷移距離及移植后在脊髓損傷附近分布情況。
　　 四、動物實驗：聯(lián)合移植后,觀察組織形態(tài)學和功能學的變化
　　 1、實驗步驟
　　 (1)制作T10右側脊髓半橫切模型。
　　 (2)實驗組A:20只,骨髓基質(zhì)干細胞和雪旺細胞聯(lián)合移植,移植細胞數(shù)量為骨髓基質(zhì)干細胞1×106個/只,雪旺細胞1×106個/只。實驗組B:20只,骨髓基

7、質(zhì)干細胞移植,移植細胞數(shù)量為骨髓基質(zhì)干細胞1×106個/只。對照組:20只,注射PBS。
　　 2、結果檢測
　　 (1)形態(tài)學檢測：術后4周,麻醉后,取材,固定,光鏡觀察損傷區(qū)囊性病變面積,通過神經(jīng)元特異性烯醇化酶,生長相關蛋白43,髓鞘堿性蛋白免疫組化檢測神經(jīng)元、軸突生長錐及髓鞘再生情況。
　　 (2)功能學檢測: 術后4周,斜板實驗觀測斜板角度,爬網(wǎng)格實驗觀察后肢運動與協(xié)調(diào)情況,并通過神經(jīng)電生理檢測誘發(fā)電位

8、波幅和潛伏期。
　　 五、統(tǒng)計學分析:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±S)表示,SPSSll.5統(tǒng)計軟件分析檢驗,P＜0.01表示有顯著差異,P＞0.05表示無統(tǒng)計學差異。
　　 結果：
　　 一、細胞培養(yǎng)：成功進行了雪旺細胞和骨髓基質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)及傳代,骨髓基質(zhì)干細胞免疫熒光鑒定CD45(-),CD44(+),并用BrdU標記。雪旺細胞S-100蛋白免疫熒光鑒定(+)。
　　 二、體外實驗：共培養(yǎng)明顯促進骨

9、髓基質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化
　　 1、鏡下觀察共存良好兩周后,鏡下觀察雪旺細胞和骨髓基質(zhì)干細胞共存良好,相互親和,骨髓基質(zhì)干細胞形成球狀集落,發(fā)出突起呈放射狀伸展,雪旺細胞沿骨髓基質(zhì)干細胞集落發(fā)出的突起呈放射狀分布,形成類似海星狀排列。
　　 2、共培養(yǎng)促進骨髓基質(zhì)干細胞向神經(jīng)元方向分化神經(jīng)元特異性烯醇化酶和BrdU熒光染色結果顯示共培養(yǎng)組向神經(jīng)元樣細胞分化率明顯高于單純骨髓基質(zhì)干細胞培養(yǎng)組。共培養(yǎng)組神經(jīng)元樣細胞分化

10、率(％)80.51±5.65,單純骨萌基質(zhì)干細胞培養(yǎng)組分化率(％)58.99±6.62,統(tǒng)計學分析,P＜0.01,有顯著差異。
　　 三、動物實驗觀察雪旺細胞明顯促進骨髓基質(zhì)干細胞體內(nèi)的遷移
　　 1、鏡下觀察遷移情況BrdU免疫組化鏡下觀察:可見脊髓標本內(nèi),BrdU標記陽性的骨髓基質(zhì)干細胞存活,核呈棕黃色,沿著脊髓灰白質(zhì)交界處有序遷移。移植細胞分布:陽性細胞主要聚集在損傷附近,隨著與損傷區(qū)的距離增加,陽性細胞逐漸減少,

11、經(jīng)統(tǒng)計學分析組間比較有顯著差異,P＜0.01。而組內(nèi)損傷區(qū)頭、尾側陽性細胞數(shù)量基本對稱分布,經(jīng)統(tǒng)計學分析無差異,P＞0.05。
　　 2、遷移距離檢測聯(lián)合移植組骨髓基質(zhì)干細胞平均遷移距離1.83±0.13cm,可最遠達2.0cm。單純骨髓基質(zhì)干細胞移植組平均遷移距離1.38±0.51cm,最遠達1-5cm。統(tǒng)計學分析組間比較P＜0.01,有顯著差異。
　　 四、聯(lián)合移植明顯促進了脊髓損傷后組織形態(tài)和功能的恢復
　　

12、 (一)形態(tài)學檢測(術后4周)
　　 1、損傷區(qū)囊變病灶檢測經(jīng)圖像分析系統(tǒng)分析所測損傷區(qū)囊變面積的像素值以聯(lián)合移植組囊變范圍最小,與單純骨髓基質(zhì)干細胞移植組比較,P＜0.01,有顯著統(tǒng)計學差異。
　　 2、神經(jīng)元、生長錐、髓鞘免疫組化檢測通過神經(jīng)元特異性烯醇化酶,生長相關蛋白43,髓鞘堿性蛋白免疫組化染色,檢測損傷區(qū)局部神經(jīng)元,軸突生長錐及髓鞘再生數(shù)量,聯(lián)合細胞移植組要明顯優(yōu)于單純骨髓基質(zhì)干細胞移植組,而PBS對照組最

13、差,方差分析P＜0.01,差異顯著。
　　 (二)功能學檢測(術后4周)
　　 1、斜板實驗及爬網(wǎng)格實驗斜板實驗顯示:聯(lián)合移植組動物斜板角度大于單純骨髓基質(zhì)干細胞移植組,P＜0.01。網(wǎng)格實驗顯示聯(lián)合移植組動物后肢運動與協(xié)調(diào)性恢復最佳,優(yōu)于單純骨髓基質(zhì)干細胞移植組,PBS對照組組最差。
　　 2、神經(jīng)電生理檢測誘發(fā)電位波幅:由高到低順序為聯(lián)合移植組,單純骨髓基質(zhì)干細胞移植組,PBS對照組。潛伏期:由快到慢為聯(lián)合移

14、植組,單純骨髓基質(zhì)干細胞移植組,PBS對照組。統(tǒng)計學分析組間比較,P＜0.01,有顯著差異。
　　 討論：脊髓損傷后,局部神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的原發(fā)及繼發(fā)性的丟失,囊性病變,膠質(zhì)瘢痕的形成,中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在的各種抑制再生因素,加上中樞神經(jīng)自身極差的再生能力,這些因素造成了脊髓損傷后結構和功能上的嚴重破壞,傳統(tǒng)的藥物及手術治療效果非常不理想。目前,脊髓損傷仍是醫(yī)學界未能攻克的難題,細胞移植作為治療策略之一,從理論上能夠更好地治療脊髓

15、損傷,即通過細胞移植,可以補充丟失的神經(jīng)元細胞,使植入的細胞與殘存的神經(jīng)元相突觸,起到上下傳導中繼作用,并能分泌有利神經(jīng)再生的因子,改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部不利再生的微環(huán)境,從而促進結構再生,達到更好的功能恢復。用于研究脊髓損傷的移植細胞包括:干細胞主要有神經(jīng)干細胞(NSC),胚胎干細胞(ESC),骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs),非干細胞主要有雪旺細胞(Sc),嗅鞘細胞(OECs),巨噬細胞等。骨髓基質(zhì)干細胞作為一種多潛能干細胞,具有其它細胞

16、無以比擬的優(yōu)勢,獲取方便,來源豐富,不涉及倫理道德問題,在宿主組織中可長期存活并整合,可自體移植,無免疫排斥的問題,體外培養(yǎng)擴增快速,能定向誘導分化為神經(jīng)元樣細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞,并經(jīng)大量試驗已證明骨髓基質(zhì)干細胞修復脊髓損傷具有良好的效果,是目前比較理想的移植細胞。而雪旺細胞是包繞于周圍神經(jīng)特有的膠質(zhì)細胞,眾所周知,周圍神經(jīng)能夠再生,它的支持和保護營養(yǎng)作用是至關重要的。由此人們自然想到了將周圍神經(jīng)的支持保護細胞雪旺細胞引入中樞,修復中樞神

17、經(jīng)損傷,取得了一定的療效。
　　 本實驗采用體外試驗將兩種細胞共培養(yǎng),證實兩種細胞能完全共存,并且互相吸引,相互支持,在雪旺細胞存在下,能促進骨髓基質(zhì)干細胞更多地向神經(jīng)元樣細胞分化。遷移結果顯示骨髓基質(zhì)干細胞在雪旺細胞支持下能夠?qū)崿F(xiàn)更遠的遷移。動物試驗將兩種細胞聯(lián)合移植,利用雪旺細胞分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)類物質(zhì),并誘導神經(jīng)元的生長錐生成,延長,還可抑制膠質(zhì)瘢痕形成等特性,發(fā)揮其能營造有利神經(jīng)再生的微環(huán)境和促進損傷神經(jīng)元的存活及軸突再生

18、的優(yōu)勢,結合骨髓基質(zhì)干細胞具有多分化潛能,在植入脊髓損傷區(qū)后可以補充缺失的神經(jīng)元,從而達到優(yōu)勢互補,更好地促進脊髓損傷后功能恢復。經(jīng)手術后行為學觀察發(fā)現(xiàn)聯(lián)合移植組大鼠癱瘓右下肢能夠較好地恢復,爬網(wǎng)格試驗顯示聯(lián)合組能用右后肢蹬踩網(wǎng)格,可攀爬陡峭網(wǎng)格,足底可暫負重行走,后肢運動協(xié)調(diào)好。而單純骨髓基質(zhì)干細胞移植上述情況明顯不及聯(lián)合移植組。斜板試驗測得角度比較,亦證實聯(lián)合移植恢復最好。脊髓損傷后由原發(fā)創(chuàng)傷及繼發(fā)損傷造成局部神經(jīng)組織壞死,形成囊腔

19、,以后為瘢痕組織占據(jù),并產(chǎn)生抑制因子阻礙神經(jīng)纖維穿過,通過鏡下觀察見聯(lián)合移植組囊腔面積較對照組明顯減小,圖像分析系統(tǒng)檢測并經(jīng)統(tǒng)計分析也證實所測囊腔面積比較,有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。說明細胞聯(lián)合移植后,移植細胞與宿主組織整合良好,可填充囊性區(qū),最大拯救了神經(jīng)壞死區(qū),有效抑制了囊性變和瘢痕組織形成,為神經(jīng)再生提供了結構上的重建。神經(jīng)元特異性烯醇化酶、生長相關蛋白43和髓鞘堿性蛋白免疫組化顯示實驗組神經(jīng)元細胞、軸突生長錐和髓鞘數(shù)量明

20、顯高于單純骨髓基質(zhì)干細胞組,經(jīng)統(tǒng)計學分析有顯著差異(P＜0.01)。考慮一方面是移植的骨髓基質(zhì)干細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細胞,起到了局部細胞替代作用,另一方面是雪旺細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子對殘存的細胞起到了最大保護作用,減少了繼發(fā)的神經(jīng)細胞死亡,同時其分泌的細胞外基質(zhì)和細胞粘附分子等促突起分子促進了軸突的再生,其自身促進髓鞘再生功能更是得到了體現(xiàn)。神經(jīng)電生理檢測,誘發(fā)電位波幅及潛伏期以聯(lián)合細胞移植組最佳。說明一方面移植的骨髓基質(zhì)干細胞與周圍神

21、經(jīng)組織形成突觸,起到了神經(jīng)傳導中繼站的作用,另一方面是雪旺細胞明顯促神經(jīng)纖維髓鞘再生的作用所致,改善了傳導束結構,從而使興奮的傳導更快捷、明顯?？傊?本實驗采用兩種細胞聯(lián)合移植,使二者相互作用,充分發(fā)揮其各自生物學效應,如雪旺細胞分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)素,保護神經(jīng)細胞,并促進髓鞘及軸突再生與修復,而骨銹基質(zhì)干細胞又具有分化神經(jīng)元的潛能,這樣既補充了缺失的神經(jīng)元細胞,又促進了軸突再生及神經(jīng)傳導束髓鞘化,抑制了不利神經(jīng)再生的各種因素,減少了膠質(zhì)瘢

22、痕和囊性病變,最大化達到了結構上的重建,為功能重建打下組織學基礎,從而更好的促進了脊髓損傷的恢復。經(jīng)查閱文獻至今還未發(fā)現(xiàn)有關骨髓基質(zhì)干細胞和雪旺細胞聯(lián)合移植的實驗研究,本實驗為進一步治療脊髓損傷奠定理論和實驗基礎。
　　 結論：
　　 1、聯(lián)合移植促進脊髓損傷后功能恢復,與單純細胞移植比較,具有優(yōu)勢。
　　 2、聯(lián)合移植可促進骨髓基質(zhì)干細胞在體內(nèi)遷移。
　　 3、共培養(yǎng),雪旺細胞能促進骨髓基質(zhì)干細胞向神經(jīng)