rAAV2-GPⅡb-GPⅢa載體構(gòu)建和體外表達、功能實驗.pdf

1、血小板無力癥是一種常染色體隱性遺傳病。由于患者基因缺陷導致血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復合物(GPⅡb/Ⅲa復合物)表達量或質(zhì)的異常，血小板對多種生理性激動劑如ADP、腎上腺素、膠原和凝血酶先天性無聚集反應或反應減低，血小板在Ⅱ期生理止血過程中不能有效地聚集形成血小板栓而導致出血。主要表現(xiàn)為自幼出現(xiàn)的程度不一的出血癥狀，可表現(xiàn)為皮膚瘀斑、鼻出血、月經(jīng)過多，直至致命的大出血。目前此病尚無有效常規(guī)治療方法，而長期輸注血小板又可引起輸注耐受。

2、 利用基因治療載體將治療基因?qū)牖颊咴煅杉毎?，對干細胞進行體外基因修飾后再回輸體內(nèi)是目前血小板無力癥基因治療的研究方向之一?；蛑委熆稍谝欢ǔ潭壬霞m正基因缺陷，甚至達到根治目的。 選擇一種安全、高效的基因轉(zhuǎn)移載體是基因治療成功的關鍵之一。1999年WilCOX等應用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體開始了對血小板無力癥進行體外修飾基因治療的相關研究，但由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體本身的安全性問題限制了它的使用，因此需要尋求其他可能的載體。2型腺相關

3、病毒(AAV-2)因具有與人類疾病無相關性、宿主范圍廣、可介導外源基因長期表達等特點，在既往研究中發(fā)現(xiàn)AAV-2對造血干細胞也具有一定的感染效率，因此選用rAAV-2作為治療載體，研究rAAV-2介導GP Ⅱb/Ⅲa基因在體外真核細胞株中的表達情況以及相關功能研究。 本研究與國家863病毒載體研發(fā)基地合作。以基地提供的通用腺相關病毒載體質(zhì)粒pSNAV-Ⅰ為基礎,構(gòu)建成以CMV為啟動子,分別含有GP Ⅱ b和GPⅢa基因的2種重組

4、質(zhì)粒。通過轉(zhuǎn)染BHK-21細胞,經(jīng)G418選擇培養(yǎng),分別得到包裝病毒用的載體紐胞株。再用rAAV2的包裝輔助病毒感染載體細胞株,細胞病變完全后行細胞裂解、酚氯仿抽提、純化后得到2種攜帶GPⅡb和GPⅢa基因的重組AAV病毒。經(jīng)PCR、HPLC、電鏡等多種方法檢測,證明所構(gòu)建的這2種重組AAV病毒構(gòu)建正確,純度好。并通過點雜交的方法測定病毒滴度。 本研究采用多種方法,從不同水平檢測了rAAV2介導的GP Ⅱ b/Ⅲa在體外真核細胞

5、株(BHK-21)的表達,并且同時分析了不同感染劑量與GP Ⅱ b和GPⅢa基因表達量之間的關系。并且通過PAC-I實驗檢驗所表達的GP Ⅱ b和GPⅢa蛋白的功能。結(jié)果表明:在MOI為1×10<'5>的條件下,感染24小時后即可在轉(zhuǎn)錄水平檢測到GP Ⅱ b和GPⅢa基因的表達;48小時可在蛋白水平檢測到GPⅡb和GPⅢa基因表達,感染48小時后免疫熒光亦可在BHK-21細胞表面檢測所表達目的基因產(chǎn)物。在量效研究中發(fā)現(xiàn),在一定劑量范圍內(nèi)

6、GP Ⅱ b和GPⅢa,蛋白表達量隨著MOI的升高而增加,但由于rAAV受體競爭性抑制的存在,過高的MOI反而是表達量下降。PAC-Ⅰ結(jié)合結(jié)果表明目的基因表達產(chǎn)物經(jīng)ADP活化后能與PAC-Ⅰ結(jié)合,具有正常的生物學活性。 本研究表明:rAAV2載體能夠有效的介導GP Ⅱ b和GPⅢa基因在體外細胞株中的表達,并且所表達產(chǎn)物具有正常的生物學活性。為重組腺相關病毒載體介導血小板無力基因治療的下一步研究打下了良好的工作基礎，為目前病毒載