26664.ebvlmp2a基因慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建及體外表達(dá)、鑒定

1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文EBVLMP2A基因慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建及體外表達(dá)、鑒定姓名：張琴申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：夏克棟張麗芳20100501溫州醫(yī)學(xué)院碩I：學(xué)位論文9士甲：口木1提取EBV標(biāo)準(zhǔn)株(B958細(xì)胞)總RNA，通過(guò)RT—PCR獲得了EBVLMP2A編碼區(qū)基因序列，經(jīng)測(cè)序比對(duì)與SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(P13285)的序列完全一致。2酶切鑒定和核苷酸測(cè)序結(jié)果表明，成功構(gòu)建了含有EBV—LMP2A。?；?/p>

2、序列的原核重組質(zhì)粒PGEX／EBV—LMP2A。訓(xùn)。。在37℃，1OmMIPTG作用下誘導(dǎo)5h能很好地表達(dá)目的蛋白，經(jīng)SDSPAGE分析相對(duì)分子量為50kDa。WesternBlot結(jié)果顯示，以His單克隆抗體作為一抗，則可見(jiàn)單一明顯條帶，與SDS—FAGE中位置吻合。用NiNTA樹(shù)脂親和層析法純化得到融合蛋白EBV—LMP2AH。。。BALB／c小鼠經(jīng)融合蛋白EBV—LMP2AH。。免疫后，經(jīng)ELISA檢測(cè)證實(shí)，獲得了具有較高效價(jià)的特

3、異性IgG免疫血清。3成功構(gòu)建了慢病毒重組質(zhì)粒CFUGW／EBV—LMP2A／EGFP和CFUGW／EBV—LMP2A，轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后經(jīng)RTPCR檢測(cè)，均可檢測(cè)到約1500bp大小的片段，與目的基因EBV—LMP2A大小一致。轉(zhuǎn)染CFUGW／EBV—LMP2A／EGFP的COS一7細(xì)胞在熒光顯微鏡下可直接觀察到熒光。轉(zhuǎn)染CFUGw／EBV—LMP2A的COS一7細(xì)胞通過(guò)間接免疫熒光的方法在共聚焦顯微鏡下可觀測(cè)到熒光。經(jīng)Western

4、Blot分析，上述兩種重組質(zhì)粒均可轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞表達(dá)54Kda的EBVLMP2A蛋白。結(jié)論1成功獲得EBVLMP2A編碼區(qū)全產(chǎn)基因序列。2通過(guò)分子克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了含EBV—LMP2A。。的重組質(zhì)粒PGEX／EBV—LMP2AH。。，在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了含EBVLMP2A。。的融合蛋白，通過(guò)親和層析法得到了純化的EBVLMP2AH。。融合蛋白，經(jīng)EBV—LMP2AH。。融合蛋白免疫BALB／c小鼠，獲得了特異性的免疫血清。3通過(guò)分