兩株新型抗人CD133單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、自從1997年Yin等報(bào)道了CD133分子（當(dāng)時(shí)命名為AC133抗原，現(xiàn)又稱人類Prominin-1）以來，該分子已成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。CD133分子已成為分離、鑒定包括造血系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等不同組織來源干細(xì)胞的新的表面標(biāo)記之一。人CD133基因編碼由865個(gè)氨基酸組成的五跨膜（5TM）糖蛋白，總分子量為120KDa。CD133分子的轉(zhuǎn)錄由5個(gè)不同的啟動(dòng)子控制，導(dǎo)致至少有12個(gè)CD133異構(gòu)體剪接形成，每個(gè)異構(gòu)體以組織特異性方式表達(dá)

2、，并受甲基化狀態(tài)調(diào)控。CD133基因的不同剪接本產(chǎn)生不同的CD133異構(gòu)體已經(jīng)逐步得以鑒定。CD133在分子量和蛋白結(jié)構(gòu)上與已知的4TM和7TM受體家族成員不同，提示CD133是5TM受體超家族中的一個(gè)新成員。同時(shí)CD133的分子結(jié)構(gòu)和蛋白表達(dá)提示它可能作為一種生長(zhǎng)因子受體而起作用，并參與細(xì)胞間信號(hào)傳遞。 CD133 mRNA在成人多個(gè)系統(tǒng)組織中表達(dá)，CD133蛋白表達(dá)在正常的造血干祖細(xì)胞和胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞，以及一些腫瘤細(xì)胞。體

3、外實(shí)驗(yàn)顯示，CD133+腫瘤細(xì)胞具有自我更新、增殖和多系分化等腫瘤干細(xì)胞（CSC）特征，越來越多的證據(jù)表明，CD133分子是人類腫瘤干細(xì)胞（CSC）標(biāo)志物之一，這提示CD133+腫瘤細(xì)胞代表了獨(dú)特的CSC群體，CD133分子可能成為新的腫瘤治療的靶點(diǎn)。但是CD133分子是否參與腫瘤干細(xì)胞的失控性增殖和自我更新尚待進(jìn)一步研究。CD133相對(duì)應(yīng)的配體分子及其細(xì)胞內(nèi)與之相互作用的下游通路分子目前均不明確，而且對(duì)CD133分子的研究缺乏有效的實(shí)

4、驗(yàn)手段。鑒此，研制抗人CD133功能性單克隆抗體將拓展對(duì)CD133分子的研究，也為腫瘤干細(xì)胞研究和生物治療提供新的途徑。 本研究首先克隆了人CD133基因，和構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)CD133的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，繼而成功地研制了兩株鼠抗人CD133單克隆抗體，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步分析。在此基礎(chǔ)上，探討了CD133分子在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)及其對(duì)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株SHI-1的生物學(xué)效應(yīng)。 一、人CD133基因的克隆、基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)

5、建以及抗人CD133單克隆抗體的研制。 目的：克隆人CD133編碼區(qū)全長(zhǎng)基因，構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)人CD133分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，進(jìn)而以此為免疫原研制抗人CD133單克隆抗體。 方法：以AC133-2抗原的基因序列為模板，通過重疊延伸PCR法克隆人CD133編碼區(qū)全長(zhǎng)基因，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證；獲得的CD133編碼區(qū)全長(zhǎng)基因經(jīng)Hind-Ⅲ和BamH-Ⅰ雙酶切后插入真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中，構(gòu)建成重組pIRES2-EGF

6、P/CD133。采用脂質(zhì)體法將重組pIRES2-EGFP/ CD133質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞，用G418抗生素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)CD133的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)分析報(bào)告基因GFP的表達(dá)及CD133分子在基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞膜上的表達(dá)。以表達(dá)人CD133分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/ CD133為免疫原，常規(guī)免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，并以表達(dá)CD133分子的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株WERI-RB-Ⅰ和L929/mock

7、分別流式篩選陽性、陰性雜交瘤克隆，經(jīng)間接免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析、反復(fù)篩選和多次克隆化培養(yǎng)，獲得2個(gè)特異性分泌鼠抗人CD133分子單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；采用細(xì)胞核染色體計(jì)數(shù)、Ig亞型快速定性試紙法、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制等實(shí)驗(yàn)，對(duì)獲得的雜交瘤細(xì)胞株及單克隆抗體進(jìn)行初步的生物學(xué)特性的鑒定。 結(jié)果： （1）成功地克隆了人CD133編碼區(qū)全長(zhǎng)基因，針對(duì)CD133編碼區(qū)全長(zhǎng)基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，能夠釋放出2600bp左右的

8、目的基因片段，DNA測(cè)序進(jìn)一步證明插入載體中的基因片段與CD133基因的序列完全一致。 （2）獲得G418抗生素耐藥的CD133基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，GFP報(bào)告基因在基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/CD133高表達(dá)，同時(shí)CD133基因轉(zhuǎn)染的L929細(xì)胞膜上能穩(wěn)定表達(dá)人CD133蛋白。 （3）成功獲得2株持續(xù)和穩(wěn)定分泌鼠抗人CD133單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為14D7和10G11。雜交瘤細(xì)胞核型分析顯示，雜交瘤

9、細(xì)胞株的染色體數(shù)目在100條以上，超過小鼠B細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù)，表明為融合體；經(jīng)過快速定性試紙分析顯示，2株單抗輕鏈均為κ鏈，14D7重鏈為IgG2a亞類，而10G11重鏈為IgG2b亞類；單抗識(shí)別的抗原表位分析結(jié)果表明，單抗10G11對(duì)商品化的抗CD133單抗AC141與CD133的結(jié)合產(chǎn)生部分競(jìng)爭(zhēng)抑制作用；而14D7對(duì)AC141與CD133的結(jié)合無競(jìng)爭(zhēng)作用，14D7和10G11之間沒有競(jìng)爭(zhēng)作用，由此表明，研制的2株抗人C

10、D133單抗14D7和10G11與商品化抗CD133單抗AC141識(shí)別的位點(diǎn)不完全相同。 結(jié)論：成功構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)人CD133分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，為研制抗人CD133單克隆抗體提供了有效的免疫原。成功獲得2株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD133單抗的雜交瘤細(xì)胞株，這2株單抗與商品化抗人CD133單抗識(shí)別CD133抗原的不完全相同位點(diǎn)。 二、鼠抗人CD133單克隆抗體的生物學(xué)特性及其對(duì)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系SHI-1的體外生物

11、學(xué)效應(yīng)。 目的：分析人CD133分子在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步分析，觀察單抗對(duì)表達(dá)CD133的人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系SHI-1的體外生物學(xué)作用，為抗CD133單抗用于腫瘤干細(xì)胞研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：采用間接免疫熒光法分析單抗對(duì)不同來源人腫瘤細(xì)胞株、人胚前腦永生化神經(jīng)前體細(xì)胞（hSN12W-TERT）以及正常入骨髓細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞的識(shí)別作用；免疫組織化學(xué)方法分析兒童髓母細(xì)胞瘤、胎盤組織CD133

12、分子的表達(dá)。研究CD133單克隆抗體14D7對(duì)SHI-1的體外生物學(xué)效應(yīng)，包括：細(xì)胞形態(tài)的動(dòng)態(tài)觀察、活細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT法分析SHI-1的增殖；PI染色和流式細(xì)胞儀分析SHI-1細(xì)胞的周期分布；Annexin V/PI染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；進(jìn)一步流式細(xì)胞儀分析單抗刺激前后SHI-1細(xì)胞CD95/CD95L、CD14以及PD-L1、PD-1、B7-H3等分子表達(dá)的改變。 結(jié)果： （1）2株單抗的免疫熒光標(biāo)記和流式分析

13、顯示，白血病來源的細(xì)胞株U937、SHI-1、腸上皮來源的Caco-2、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-RB-Ⅰ和Y79表達(dá)人CD133分子，正常入骨髓細(xì)胞有CD133的低表達(dá)；人胚前腦永生化神經(jīng)前體細(xì)胞（hSN12W-TERT）高表達(dá)人CD133分子。 （2）2株抗體的免疫組織化學(xué)染色法也顯示，成人胎盤和兒童髓母細(xì)胞瘤表達(dá)CD133。 （3）單抗14D7加入SHI-1細(xì)胞體外培養(yǎng)后形態(tài)觀察顯示，細(xì)胞數(shù)量逐步減少，細(xì)胞呈不規(guī)則型

14、，胞體固縮，出現(xiàn)較多細(xì)胞碎片；活細(xì)胞計(jì)數(shù)法和MTT法結(jié)果表明，單抗14D7能明顯抑制SHI-1細(xì)胞增殖，并呈劑量和時(shí)間依賴性效應(yīng)；Annexin V/PI染色顯示，單抗14D7作用后，細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡和細(xì)胞周期的G1/S期阻滯；免疫熒兆標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，單抗14D7作用后12h，SHI-1細(xì)胞表面CD95和CD95L分子均上調(diào)表達(dá)，免疫協(xié)同抑制分子PD-L1、PD-1、B7-H3表達(dá)下調(diào)，而分化抗原CD14亦呈一過性表達(dá)下調(diào)（刺激后

15、18-24h最顯著）。 結(jié)論：使用本實(shí)驗(yàn)研制的2株單克隆抗體免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞分析顯示，CD133分子在一些腫瘤細(xì)胞株表達(dá)。免疫組化分析表明CD133分子表達(dá)在成人胎盤和兒童髓母細(xì)胞瘤，由此提示所獲得的2株特異性單抗不僅可以作流式分析，而且還可以用于免疫組化分析。單抗14D7通過作用于SHI-1細(xì)胞表達(dá)的CD133分子，誘導(dǎo)SHI-1細(xì)胞周期的G1/S期阻滯，抑制SHI-1細(xì)胞增殖，通過活化CD95/CD95L途徑促發(fā)凋亡性

16、細(xì)胞死亡，同時(shí)還下調(diào)協(xié)同抑制分子PD-L1、PD-1和B7-H3的表達(dá)，由此表明：本實(shí)驗(yàn)所研制的特異性抗人CD133單抗14D7是一株CD133的功能性抗體，將為研究CD133的生物學(xué)功能和腫瘤干細(xì)胞提供新的手段。 小結(jié)： （1）克隆獲得人CD133編碼區(qū)的全長(zhǎng)基因，構(gòu)建了基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/CD133。 （2）以L929/CD133為免疫原免疫小鼠研制獲得2株特異性鼠抗人CD133單克隆抗體14D7和10G