鼠抗人4-1BBL單克隆抗體制備及其生物學(xué)功能的研究.pdf

1、4-1BBL（CD137L）是Ⅱ型跨膜糖蛋白分子，與其受體4-1BB同為共刺激分子TNF/TNFR超家族中的重要成員。4-1BBL分子表達(dá)在各種活化的免疫細(xì)胞表面，如：B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、活化的T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，但在未活化的T細(xì)胞上不表達(dá)。另有研究顯示，在某些腫瘤細(xì)胞表面也有4-1BBL分子的表達(dá)。4-1BBL的表達(dá)與惡性血液病有關(guān)：如惡性血液病患者的血清中可溶性4-1BBL（s4-1BBL）含量異常升高；另外，在某些T和B腫

2、瘤細(xì)胞系，雖然4-1BBL/4-1BB呈較低的構(gòu)成性共表達(dá)，但4-1BBL/4-1BB信號(hào)均可促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖并參與白血病細(xì)胞耐受抗腫瘤藥物的機(jī)制。4-1BBL分子與其受體4-1BB結(jié)合后可介導(dǎo)雙向信號(hào)。研究表明，兩者相互作用產(chǎn)生的正向信號(hào)可促進(jìn)活化的T細(xì)胞增殖，這一過程并不依賴CD28信號(hào)；而通過膜4-1BBL傳遞的逆向信號(hào)可以抑制活化T細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡；4-1BBL逆向信號(hào)還能誘導(dǎo)單核細(xì)胞活化，促進(jìn)其IL-6、IL-8和TNF

3、-α的分泌以及M-CSF的產(chǎn)生，并延長其生存；逆向信號(hào)還能刺激CD34+造血干細(xì)胞來源的DC成熟等，如4-1BBL逆向信號(hào)可以上調(diào)DC細(xì)胞上CD86、CD83的表達(dá)以及IL-12的分泌。因此，4-1BBL/4-1BB介導(dǎo)雙向信號(hào)在T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞（DC）介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。但這種4-1BB/4-1BBL雙向信號(hào)在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中的作用和確切機(jī)理尚待深入研究和全面理解。為此，制各特異性抗人4-1BBL分子單

4、克隆抗體，具備重要的研發(fā)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)制備了一株鼠抗人4-1BBL單克隆抗體39A8，能夠識(shí)別多種腫瘤細(xì)胞株，同時(shí)以表達(dá)4-1BBL分子的人單核白血病細(xì)胞株U937、THP-1及膠質(zhì)瘤細(xì)胞株675321為研究對(duì)象，初步研究了單克隆抗體39A8對(duì)腫瘤細(xì)胞體外生長的影響。本論文共分為兩個(gè)部分。
　　 1.鼠抗人4-1BBL單抗的雜交瘤細(xì)胞株的制備
　　 以基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/4-1BBL作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，采用

5、B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，將免疫小鼠的脾臟和小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)。以L929/4-1BBL為陽性篩選細(xì)胞株，以L929細(xì)胞為陰性對(duì)照，通過間接免疫熒光標(biāo)記法對(duì)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選。用有限稀釋法進(jìn)行陽性雜交瘤的亞克隆化培養(yǎng)。經(jīng)過多次亞克隆及反復(fù)篩選，最終得到一株持續(xù)分泌抗人4-1BBL單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（39A8），經(jīng)快速定性試紙法鑒定，39A8的重鏈IgG2a，輕鏈為κ鏈。雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)體外連續(xù)

6、傳代培養(yǎng)，液氮凍存半年后復(fù)蘇，仍生長良好，穩(wěn)定分泌抗體。
　　 2．鼠抗人4-1BBL單克隆抗體的體外生物學(xué)特性研究
　　 間接免疫熒光法標(biāo)記U937、THP-1、Hela、PC-3、Daudi、M231、SHG44等細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞膜熒光標(biāo)記百分率和熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，4-1BBL能不同程度地在某些腫瘤細(xì)胞株上表達(dá)。將不同濃度的4-1BBL單抗分別加入到天然表達(dá)4-1BBL分子的U937、THP-1、6753

7、21細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，分別在培養(yǎng)24h，48h、72h和96h，觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)、計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量并繪制生長曲線。研究結(jié)果顯示：4-1BBL單抗39A8可促進(jìn)上述三種細(xì)胞的生長與增殖。
　　 綜上所述，本研究成功制備了一株特異性的鼠抗人4-1BBL單克隆抗體，進(jìn)而鑒定了其生物學(xué)特性；利用抗人4-1BBL單抗初步探討了4-1BBL逆向信號(hào)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。因此，這株功能性鼠抗人4-1BBL單克隆抗體的成功制備為其以后的生物學(xué)功