核轉(zhuǎn)錄因子HMBOX1對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特征的調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、目的
　　 肝癌是指發(fā)病于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。中國(guó)是原發(fā)性肝癌的高發(fā)區(qū)，每年死于肝癌的患者人數(shù)占全世界總數(shù)的一半以上。肝癌的常規(guī)治療手段主要包括手術(shù)、射頻消融和放化療等，生物治療是近些年來(lái)新興的治療方法，為那些無(wú)法或不愿接受常規(guī)治療的患者提供了一個(gè)新選擇。
　　 肝癌患者的愈后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其難以被徹底治愈的根本原因，研究發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)殘存的腫瘤干細(xì)胞可能在此過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。在肝癌組織中，CD

2、133陽(yáng)性的細(xì)胞擁有比其它細(xì)胞更強(qiáng)的腫瘤惡性表型，被認(rèn)為是肝癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志，因此若能在治療腫瘤干細(xì)胞方面取得突破性的進(jìn)展，必將具有重要的理論價(jià)值和社會(huì)意義。
　　 HMBOX1是2006年從人胰腺cDNA文庫(kù)中分離出來(lái)的新基因，屬于Homeobox家族，最近又發(fā)現(xiàn)了它的一個(gè)剪接變體HMBOX1b。研究發(fā)現(xiàn)，HMBOX1是一種潛在的核轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制活性。關(guān)于HMBOX1功能的研究很少，集中在其對(duì)NK細(xì)胞功能及骨髓基質(zhì)細(xì)

3、胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的調(diào)控作用，但具體的分子機(jī)制仍不清楚。以往的研究證實(shí)，HMBOX1同基因簇基因HNF-1α具有抗腫瘤活性，但有關(guān)HMBOX1與腫瘤關(guān)系的研究仍未有報(bào)道。
　　 本研究中，我們?cè)噲D通過(guò)構(gòu)建HMBOX1/HMBOX1b過(guò)表達(dá)載體，來(lái)研究HMBOX1與肝癌細(xì)胞系HepG2腫瘤生物學(xué)特征之間的關(guān)系，期望尋找到一種新的肝癌生物治療方法。
　　 方法
　　 1.免疫組化檢測(cè)臨床標(biāo)本HMBOX1表達(dá)水平;<

4、br>　　 2.PCR和WesternBlot檢測(cè)多種腫瘤細(xì)胞系HMBOX1的mRNA水平和蛋白水平;
　　 3.利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建HMBOX1/HMBOX1b與EGFP融合表達(dá)的真核表達(dá)載體;
　　 4.免疫熒光技術(shù)研究HMBOX1/HMBOX1b的亞細(xì)胞定位特征;
　　 5.CCK-8和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)HMBOX1的HepG2細(xì)胞的增殖能力以及細(xì)胞周期;
　　 6.PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)HMBO

5、X1的HepG2細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因以及促炎基因的表達(dá);
　　 7.MTT方法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)HMBOX1的HepG2細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷敏感性及殺傷相關(guān)分子表達(dá);
　　 8.基因芯片技術(shù)分析HMBOX1可能參與調(diào)控的信號(hào)通路和細(xì)胞分子生物學(xué)功能。
　　 結(jié)果
　　 1.HMBOX1的表達(dá)水平與肝癌組織的分化程度存在正相關(guān)關(guān)系;
　　 2.HMBOX1在多種肝癌細(xì)胞系中存在低表達(dá)現(xiàn)象;

6、r>　　 3.成功構(gòu)建了pEGFP-N1-HMBOX1、pEGFP-N1-HMBOX1b真核過(guò)表達(dá)載體;
　　 4.HMBOX1的亞細(xì)胞定位存在不均一性，HMBOX1b與HMBOX1的亞細(xì)胞定位有所不同;
　　 5.過(guò)表達(dá)HMBOX1對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞周期無(wú)明顯影響;
　　 6.過(guò)表達(dá)HMBOX1能下調(diào)HepG2細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因和促炎基因表達(dá);
　　 7.過(guò)表達(dá)HMBOX1的Hep

7、G2細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷敏感性增強(qiáng);
　　 8.HMBOX1可能參與了多條腫瘤和免疫相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，可能與組織器官和細(xì)胞的發(fā)育分化有關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 HMBOX1作為一種發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制活性的轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能和促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化的作用，目前尚不清楚該基因與腫瘤之間是否存在一定的調(diào)控關(guān)系。本研究根據(jù)本課題組早期研究中觀察到的肝癌組織中HMBOX1的低表達(dá)現(xiàn)象，進(jìn)一步通過(guò)臨床標(biāo)本的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HMB

8、OX1與腫瘤組織的分化程度呈正相關(guān)關(guān)系，并且HMBOX1在多種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯低于正常肝細(xì)胞。據(jù)此我們推測(cè)，HMBOX1可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展存在一定的關(guān)系。
　　 通過(guò)構(gòu)建EGFP融合的HMBOX1/HMBOX1b表達(dá)載體，研究了HMBOX1和HMBOX1b的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)HMBOX1在細(xì)胞內(nèi)的定位具有特殊性，其剪接變體HMBOX1b的細(xì)胞定位與HMBOX1有所不同。通過(guò)對(duì)HMBOX1過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞系HepG2研究

9、發(fā)現(xiàn)，HMBOX1能下調(diào)HepG2細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因和促炎基因的表達(dá)，而其剪接變體HMBOX1b則未表現(xiàn)出類似的活性。HMBOX1可能參與了腫瘤和免疫相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控，并可能對(duì)組織器官和細(xì)胞的發(fā)育分化有一定的調(diào)控作用;同時(shí)HMBOX1能增強(qiáng)HepG2對(duì)NK的殺傷敏感性，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。
　　 本研究首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子HMBOX1與肝癌之間的調(diào)控關(guān)系，初步探討了其抗肝癌作用，但具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。為肝癌的治療、診斷預(yù)后