孕三烯酮微球治療大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的藥效學(xué)研究及機(jī)制探討.pdf

1、目的： 研究孕三烯酮微球在大鼠體內(nèi)的長效作用和對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的治療效果并探討孕三烯酮治療子宮內(nèi)膜異位癥的機(jī)制。 方法： 1．選取動(dòng)情周期規(guī)則的大鼠，單次皮下注射孕三烯酮微球后，陰道涂片，記錄動(dòng)情間期持續(xù)的天數(shù)，了解藥物在大鼠體內(nèi)的釋藥時(shí)間。 2．采用外科移植法建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，三周后剖腹，模型成功者隨機(jī)分為五組，分別為溶劑對照組，卵巢去勢組，孕三烯酮微球1．3mg／kg／lOd、4．Omg

2、／kg／lOd和12．Omg／kg／lOd組。給藥后20天后解剖，測量異位內(nèi)膜體積，了解孕三烯酮微球?qū)Υ笫螽愇粌?nèi)膜體積的影響。 3．解剖時(shí)，腹主動(dòng)脈取血，磁分離酶聯(lián)免疫測定法測度大鼠體內(nèi)的雌二醇(E2)、孕酮(P)水平，并取出子宮及移植異位內(nèi)膜，固定、切片，免疫組化SP法測定各組動(dòng)物子宮及移植異位內(nèi)膜的雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)的表達(dá)，了解孕三烯酮對大鼠E2、P及ER、PR表達(dá)的影響。 4．采用膠原酶消化，2

3、00目的尼龍篩過濾，傳代2次，體外分離、純化及培養(yǎng)內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，建立內(nèi)異癥的體外細(xì)胞模型。 5．間質(zhì)細(xì)胞(F2)以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)后，分別以含或不含終濃度為100nM的孕三烯酮的無血清DMEMS／F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，然后用基因芯片法，尋求差異表達(dá)基因，并用實(shí)時(shí)定量RT—PCR法對差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，了解孕三烯酮在體外對內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞部分細(xì)胞因子表達(dá)的影響。 結(jié)果： L大鼠

4、皮下注射單劑量孕三烯酮微球3．0、6．0、12．Omg／kg后1～3天內(nèi)，陰道涂片出現(xiàn)白細(xì)胞，并分別持續(xù)了12．83、14．50、16．83天，與對照組比較差異顯著(P

5、／lOd劑量組差異顯著，而微球1．3mg／kg／lOd劑量組差異不明顯。提示孕三烯酮微球L3mg／kg／10d劑量時(shí)對異位內(nèi)膜無明顯抑制作用，而4．Omg／kg／10d和12．Omg／kg／10d劑量時(shí)對異位內(nèi)膜有明顯的抑制作用，尤以4．Omg／kg／lOd劑量效果顯著。12．Omg／kg／10d劑量時(shí)抑制率要低于4．Omg／kg／10d劑量，但兩者差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．514)。 3．與陰性對照組比較，孕三烯酮12．Omg

6、／kg／lOd劑量能顯著降低大鼠體內(nèi)的P(P<0．01)和E2水平(P<0．05)，而4．Omg／kg／10d劑量雖然亦能使體內(nèi)E1、P降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1．3mg／kg／10d劑量時(shí)，體內(nèi)E2、P水平較對照組升高，但亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4．免疫組化結(jié)果顯示：職、PR在大鼠子宮腺上皮細(xì)胞、腔上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，其中以腺上皮細(xì)胞表達(dá)為強(qiáng)。大鼠移植異位子宮內(nèi)膜的ER、PR表達(dá)量均較在位子宮內(nèi)膜下降(P值分別

7、O．05)。孕三烯酮4．Omg/kg／lOd和12．Omg／kg／10d劑量使大鼠在位和異位子宮內(nèi)膜ER、PR表達(dá)的平均灰度顯著增高(P

8、胞生長因子一18(FGFl8)、白介素-lb(IL-lb)、白介素一2(IL一2)、血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長因子B(PDGFB)、中期因子(mdkine，MK)、Neuregulin2(NRG2)、Neuropi¨n2(NRP2)共9種基因表達(dá)下調(diào)。實(shí)時(shí)定量RT一PCR驗(yàn)證分析的結(jié)果和基因芯片結(jié)果一致。 結(jié)論： 雌性大鼠單劑量注射孕三烯酮微球后，動(dòng)情周期連續(xù)2周受抑制，說明孕三烯酮微球能夠抑制大鼠排卵，在體內(nèi)能夠維持2周的

9、時(shí)間，具有緩釋長效作用。孕三烯酮微球4．Omg／kg／10d和12．Omg／kg／10d劑量時(shí)能夠減小大鼠異位內(nèi)膜的體積，抑制大鼠異位內(nèi)膜的生長，對內(nèi)異癥有良好的治療作用。 通過外科移植法建立的大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型中，移植異位子宮內(nèi)膜的ER、PR表達(dá)量較在位子宮內(nèi)膜下降，可能與異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的生長的外部條件不同有關(guān)。 孕三烯酮微球使大鼠體內(nèi)E2、P下降明顯，但未達(dá)到去勢水平。能夠顯著降低大鼠子宮內(nèi)膜及移植異位內(nèi)膜上

10、皮、腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ER、PR的表達(dá)。孕三烯酮對內(nèi)異癥的治療作用，主要通過作用于脒、PR，通過下調(diào)激素受體的表達(dá)，抑制雌孕激素與受體的結(jié)合而發(fā)揮抗雌孕激素作用。 在體外，孕三烯酮能夠下調(diào)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞EGF、FGF4、FGFl8、PDGF2、兒一113、IL2、Midkine、Neuregulin2、Neuropilin2基因的表達(dá)。這些基因大部分已公認(rèn)與內(nèi)異癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，少數(shù)基因與內(nèi)異癥的關(guān)系，目前還未見報(bào)道，但