孕三烯酮微球治療子宮肌瘤藥效學(xué)研究及作用機(jī)制探討.pdf

1、目的：研究孕三烯酮微球?qū)嶒炐噪嗍笞訉m肌瘤的治療效果及對體外培養(yǎng)子宮肌瘤細(xì)胞的影響，探討孕三烯酮治療子宮肌瘤可能涉及的相關(guān)機(jī)制。 方法： 1．單次給予孕三烯酮微球注射液后，考察食蟹猴體內(nèi)孕三烯酮血藥濃度的變化。 2．選用動情周期規(guī)則的大鼠，單次皮下注射孕三烯酮微球后，陰道涂片，觀察孕三烯酮對SD大鼠性周期的影響，確定孕三烯酮是否具有長效作用。 3．采用去勢雌性豚鼠，外源性給予雌激素(E<,2>)(50或1

2、00gg/只，每周2或3次，分別于第8、12和16周時解剖動物，觀察子宮形態(tài)變化，計算子宮臟器系數(shù)，子宮組織切片，HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，建立適宜的豚鼠子宮肌瘤模型。 4．利用外源性E2誘導(dǎo)的子宮肌瘤模型，于第7～16周皮下注射孕三烯酮微球2、4和8mg/kg，每10天一次，給藥10周后處死動物，解剖觀察子宮形態(tài)變化，計算子宮臟器系數(shù)；子宮組織切片，HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，觀察孕三烯酮微球?qū)﹄嗍笞訉m肌瘤模型的影響；測

3、定動物體內(nèi)雌激素(E<,2>)和孕激素(P)水平。 5．利用人子宮肌瘤組織和瘤旁肌層組織，采用膠原酶消化，體外培養(yǎng)人子宮肌瘤和肌層細(xì)胞，并建立子宮肌瘤有限細(xì)胞系，考察孕三烯酮對剝奪 E<,2> 子宮肌瘤細(xì)胞的影響。 6．利用外源性E<,2>誘導(dǎo)的子宮肌瘤模型和剝奪E<,2>子宮肌瘤細(xì)胞，運(yùn)用免疫組化、Westernblot和實時熒光定量RT-PCR，考察正常子宮和肌瘤中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、磷酸化雌激素

4、受體(Phospho-<'167>ER)以及磷酸化孕激素受體(Phospho-<'190>pR)的表達(dá)差異，并研究孕三烯酮在外源性E<,2>存在和不存在情況下對ER、PR、Phospho-<'167>ER以及Phospho-<'190>pR表達(dá)的影響。 7．研究孕三烯酮對外源性E<,2>誘導(dǎo)的子宮肌瘤和剝奪E<,2>子宮肌瘤細(xì)胞周期和凋亡的影響。 8．采用人腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因芯片測定子宮肌層和肌瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)，比較

5、子宮肌層和肌瘤細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，篩選影響肌瘤形成的信號傳導(dǎo)通路，考察孕三烯酮對子宮肌瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因芯片中基因表達(dá)的影響。 9．利用外源性E2誘導(dǎo)的子宮肌瘤模型和剝奪E<,2>子宮肌瘤細(xì)胞，運(yùn)用免疫組化、Westemblot和實時熒光定量RT-PCR方法，考察正常子宮和肌瘤中酪氨酸激酶(c-Src)以及磷酸化酪氨酸激酶(Phospho-<'416>SrC)的表達(dá)差異，研究孕三烯酮在外源性雌激素存在和不存在情況下對c-S

6、rc以及Phospho-<'416>Src表達(dá)的影響。 10．運(yùn)用免疫沉淀方法初步考察ER/c-Src的相互作用，初步探討孕三烯酮對ER/c-Src的相互作用的影響。 結(jié)果： 1．食蟹猴單次皮下注射給予孕三烯酮微球注射液0.6、2和6mg/kg，給藥30分鐘后即可達(dá)血藥濃度高峰，釋放時間為約490小時，有效濃度可維持約350小時。 2．SD大鼠單次皮下注射孕三烯酮微球3.5、7.0和14.0mg/kg后，

7、動情間期持續(xù)時間延長，連續(xù)2周抑制排卵。 3．雙側(cè)摘除卵巢、性成熟的雌性豚鼠，皮下注射E<,2> 100μg/只，2次/周，連續(xù)12周后，豚鼠子宮增生、膨大，形態(tài)明顯改變，部分動物子宮有肉眼可見的肌壁間瘤和漿膜下肌瘤形成；并伴有繼發(fā)性改變。病理組織學(xué)檢查可見，增生的子宮肌細(xì)胞呈長梭形，編織狀或柵狀排列，細(xì)胞核呈短棒狀或卵圓形，顯示明顯的子宮肌瘤特征，與人子宮肌瘤病理組織學(xué)特征相似。 4．利用E<,2>誘導(dǎo)的豚鼠子宮肌瘤模

8、型，皮下注射給予孕三烯酮微球注射液2、4和8mg/kg，1次/10天，連續(xù)10周后，可見子宮增殖程度較輕，肉眼未見肌瘤形成；與模型組相比，子宮重量和臟器系數(shù)顯著降低(P<0.05)，病理檢查顯示肌細(xì)胞排列接近正常對照組。在4和8 mg/kg時，孕三烯酮微球以劑量依賴性方式抑制血清E<,2>濃度。 5．孕三烯酮可明顯抑制剝奪E<,2>的子宮肌瘤細(xì)胞的生長。IC50值為26.7μmol/L。 6．剝奪E<,2>的肌瘤細(xì)胞中E

9、RmRNA和PR mRNA水平低于瘤旁子宮肌層細(xì)胞，但二者的蛋白水平和磷酸化蛋白水平高于瘤旁子宮肌層細(xì)胞。肌瘤細(xì)胞中ER和PR的磷酸化修飾可以不依賴E<,2>。 7．在外源性E<,2>存在時，孕三烯酮(2、4和8 mg/kg)可下調(diào)ER、PR和PRB的表達(dá)。在剝奪E<,2>的子宮肌瘤細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)錄水平：孕三烯酮0.1，1和10pmol/;L時ERotmRNA下調(diào)趨勢更明顯，而：ERβmRNA水平則呈上調(diào)趨勢。在蛋白水平：孕三烯酮

10、(0.1，1和10gmol/L)以劑量依賴性方式下調(diào)ER、PR及其磷酸化蛋白Phosoho-<'167>ER和Phospho-<'190>PR的表達(dá)。 8．在E2誘導(dǎo)的豚鼠子宮肌瘤組織，孕三烯酮2、4和8mg/kg組細(xì)胞凋亡率與模型組和正常對照相比未見明顯變化(P>0.05)；在剝奪E<,2>的子宮肌瘤細(xì)胞，孕三烯酮對子宮肌瘤細(xì)胞凋亡率的影響與溶劑對照組相似。RU486可明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 9．與瘤旁子宮肌層細(xì)胞基因表達(dá)

11、譜相比，在腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及的15條通路96個被測基因中，子宮肌瘤細(xì)胞基因表達(dá)譜中22條基因明顯上調(diào)，25條基因明顯下調(diào)，上調(diào)的差異基因主要涉及的信號通路包括：低氧通路、炎癥通路(NF-kB通路和Cox-2通路)、STAT通路、WNT通路、雄激素通路和Hedgehog通路；而雌激素通路、抗細(xì)胞增殖通路(TGFβ通路)及與凋亡相關(guān)的細(xì)胞幸存(P13K/AKT)通路和DNA損傷/p53通路相關(guān)的基因水平變化較小。 10．給予孕三烯酮3

12、gmol/L作用36小時后，子宮肌瘤基因表達(dá)譜中，下調(diào)11條基因明顯上調(diào)，46條基因明顯下調(diào)，下調(diào)基因主要涉及炎癥通路(NF-kB通路)、激素-通路(雌激素與雄激素通路)、低氧通路、WNT通路、Hedgehog通路、STAT通路、Wint通路和抗細(xì)胞增殖通路(TGFp通路)。而與凋亡相關(guān)的細(xì)胞幸存(P13K/AKT)通路、DNA損傷/p53通路、熱激通路和p38/JNK通路的相關(guān)基因水平變化較小。 11．免疫組化結(jié)果顯示，在正常

13、子宮肌層細(xì)胞，c-Src陽性表達(dá)部位在細(xì)胞漿和細(xì)胞核周；在子宮肌瘤細(xì)胞，c-Src陽性表達(dá)部位在細(xì)胞核。在E<,2>誘導(dǎo)的子宮肌瘤模型中，模型組豚鼠子宮肌細(xì)胞c-Src的陽性表達(dá)率明顯高于正常對照組(p<0.05)，孕三烯酮2、4和8mg/kg組c-Src的陽性表達(dá)率降低(p<0.05)。給予孕三烯酮0.1～11amol/L，后，細(xì)胞核著色淡，陽性反應(yīng)程度和反應(yīng)率降低。 12．在轉(zhuǎn)錄水平，剝奪E<,2>的肌瘤細(xì)胞中c-Src m

14、RNA含量高于瘤旁子宮肌層細(xì)胞，孕三烯酮0.1～10gmol/L可以劑量依賴性方式降低肌瘤細(xì)胞中c-Src mRNA表達(dá)。 13．蛋白水平：在E<,2>誘導(dǎo)的豚鼠子宮肌瘤組織，C-SrC和phospho-<'416>Stc蛋白含量明顯高于正常對照組(P<0.05)，孕三烯酮2～8mg/kg可明顯下調(diào)c-Src和phospho-<'416>Src蛋白表達(dá)；在剝奪E<,2>的子宮肌瘤細(xì)胞，c-Src mRNA蛋白含量明顯高于瘤旁子宮

15、肌層細(xì)胞(P<0．05)，孕三烯酮0.1～10gmol/L可以明顯降低肌瘤細(xì)胞中C-SrC和phospho-<'416>Stc蛋白表達(dá)(P<0.05)。 結(jié)論： 1．性成熟的雌性豚鼠，雙側(cè)摘除卵巢后，皮下注射E<,2> 100μg/只，2次/周，連續(xù)12～16周，可成功建立豚鼠子宮肌瘤動物模型。 2．孕三烯酮微球具有長效緩釋作用。 3．皮下注射孕三烯酮微球注射液在2、4和8 mg/kg時以劑量依賴性方式抑

16、制E<,2>誘導(dǎo)的豚鼠子宮肌瘤形成，孕三烯酮的抗子宮肌瘤作用部分與其較強(qiáng)的抗雌激素作用有關(guān)。 4．在剝奪E<,2>的子宮肌瘤細(xì)胞，孕三烯酮可明顯抑制子宮肌瘤細(xì)胞的生長，IC50值為26.7pxnol/L。 5．首次發(fā)現(xiàn)，在剝奪E<,2>的肌瘤細(xì)胞，ER和PR的磷酸化修飾可以不依賴雌激素。孕三烯酮可在蛋白水平下調(diào)ER、PR及其磷酸化水平，在轉(zhuǎn)錄水平以不同方式調(diào)節(jié)ERmRNA和PRmRNA的表達(dá)。在外源E<,2>存在時，孕三

17、烯酮可下調(diào)ER、PR和PRB的表達(dá)。 6．無論是否存在外源性E<,2>，孕三烯酮均無明顯誘導(dǎo)肌瘤細(xì)胞凋亡的作用，與RU4867．子宮肌瘤的形成可能與低氧、炎癥、有絲分裂以及磷酸化信號通路活躍有關(guān)。首次發(fā)現(xiàn)，孕三烯酮可通過影響炎癥、低氧、激素、有絲分裂以及磷酸化相關(guān)信號通路阻止肌瘤細(xì)胞增殖，而與細(xì)胞凋亡關(guān)系較小。 8．首次發(fā)現(xiàn)，酪氨酸激酶c-Src的表達(dá)可能與子宮肌瘤形成有關(guān)，c-Src的高表達(dá)與可以不依賴于E<,2>，但