產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌EtpA與LT B共表達(dá)載體的構(gòu)建及免疫原性分析.pdf

1、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起仔豬腹瀉的主要病原之一。該菌的致病性與其毒力因子密切相關(guān)。EtpA為新發(fā)現(xiàn)的由ETEC分泌的胞外蛋白，類似粘附素，介導(dǎo)菌毛與宿主細(xì)胞的粘附，具有一定的免疫原性。熱敏腸毒素LTB是ETEC致腹瀉的免疫活性中心，具有免疫佐劑活性。ETEC具有多種血清型，現(xiàn)有疫苗不能有效防控ETEC。基于此，本研究擬構(gòu)建EtpA與LTB表達(dá)載體，制備疫苗，分

2、析疫苗對(duì)小鼠的免疫效果，探索ETEC DNA疫苗免疫的可行性，從而為ETEC免疫防控提供依據(jù)。
　　根據(jù)NCBI公布的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenic E.coli， ETEC)的不耐熱腸毒素B亞單位抗原和菌毛蛋白EtpA的核苷酸序列進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到EtpA和LTB基因。膠回收純化后將EtpA和LTB基因分別連接于克隆載體pEASY-Blunt上，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5a細(xì)胞中，然后篩選陽(yáng)性

3、菌落進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序，結(jié)果證明連接產(chǎn)物中分別含有EtpA和LTB，并分別命名為pEA-EtpA和pEA-LTB。將鑒定結(jié)果正確的重組質(zhì)粒與原核表達(dá)載體pET32a及真核表達(dá)載體pcDNA3.1用BamHⅠ和XhoⅠ分別酶切，目的基因通過(guò)T4 DNA連接酶將到真核和原核表達(dá)載體中，并通過(guò)菌落PCR和質(zhì)粒酶切進(jìn)行鑒定，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-EtpA與pET-LT B及真核表達(dá)載體pcDNA-EtpA與pcDNA-LTB。將重組質(zhì)粒

4、pET-EtpA與pET-LT B分別轉(zhuǎn)化入感受態(tài)BL21(DE3)細(xì)胞中，在一定濃度的IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行蛋白表達(dá)，最后通過(guò)SDS-PAGE、Western-Blot檢測(cè)鑒定了所表達(dá)的蛋白。
　　按照常規(guī)方法，分別制備了含有EtpA與LTB質(zhì)?；虻鞍椎暮怂嵋呙缗c蛋白疫苗。將制備的EtpA蛋白疫苗、EtpA/LT B蛋白疫苗和pcDNA-EtpA DNA疫苗、pcDNA-EtpA/pcDNA-LT B DNA疫苗免疫Balb/c小鼠，

5、通過(guò)建立好的ELISA方法檢測(cè)并分析疫苗對(duì)小鼠產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)GraphPad Prism5進(jìn)行分析和作圖，結(jié)果反映出了EtpA/LTB蛋白疫苗免疫的小鼠產(chǎn)生的抗體水平顯著高于PBS空白對(duì)照組(P＜0.05)，且制備的四種疫苗均可以引起小鼠體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生特異性的抗體。通過(guò)脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)分析疫苗對(duì)小鼠產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答的效果。結(jié)果表明免疫后的第四周，免疫組的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖變化比較大，其中EtpA/LTB蛋白

6、疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖變化顯著強(qiáng)于PBS空白對(duì)照組(P＜0.05)，pcDNA-EtpA/pcDNA-LT B DNA疫苗組的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖變化顯著強(qiáng)于pcDNA3.1空載體質(zhì)粒對(duì)照組和PBS空白對(duì)照組(P＜0.05)。證明制備的疫苗也可以引起細(xì)胞免疫。對(duì)免疫后的小鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)制備疫苗的保護(hù)性。通過(guò)對(duì)結(jié)果分析表明，制備的四種疫苗對(duì)攻毒的小鼠均具有保護(hù)性，且加入LTB佐劑的疫苗組的保護(hù)率高于未加的，證明了LTB的免疫佐劑的作用