miRNA-21對(duì)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌黏附Hela細(xì)胞調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、miR-21是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種小RNA分子，在腫瘤發(fā)生及機(jī)體免疫調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。miR-21可通過(guò)調(diào)控IL-12、TLR4和NF-kB等基因的表達(dá)，影響機(jī)體的免疫力，在抗微生物感染中發(fā)揮重要作用。經(jīng)miRNA在線靶目標(biāo)預(yù)測(cè)軟件分析發(fā)現(xiàn)，miR-21靶基因中有許多黏附相關(guān)因子，而腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)通過(guò)產(chǎn)生的黏附素與細(xì)胞表面受體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)菌黏附宿主細(xì)胞，是ETEC感染致病的前

2、提條件。但有關(guān)miR-21對(duì)ETEC黏附宿主細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制尚屬未知。為研究miR-21對(duì)ETEC黏附Hela細(xì)胞的調(diào)控作用，本研究應(yīng)用脂質(zhì)體將pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR-21真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，并按ETEC:Hela=100:1的濃度作用不同時(shí)間，利用MTT法和Giemsa染色法檢測(cè)miR-21對(duì)ETEC黏附Hela細(xì)胞的影響，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)不同作用時(shí)間Hela細(xì)胞CCL20、TGFB

3、I、ITGB8等黏附相關(guān)基因表達(dá)變化，以揭示miRNA-21對(duì)ETEC黏附Hela細(xì)胞的影響與調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　 1. 將重組miR-21真核表達(dá)載體和陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，ETEC與過(guò)表達(dá)miR-21的Hela細(xì)胞相互作用不同時(shí)間后，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-21的Hela細(xì)胞黏附的ETEC數(shù)量比轉(zhuǎn)染對(duì)照組黏附ETEC顯著減少（P＜0.05)，說(shuō)明miR-21能抑制ETEC黏附Hela細(xì)胞

4、。
　　 2.ETEC黏附過(guò)表達(dá)miR-21的Hela細(xì)胞后，經(jīng)Giemsa染色后觀察，可見(jiàn)大量紫色的桿狀細(xì)菌緊密黏附于Hela細(xì)胞表面，細(xì)胞中藍(lán)色為細(xì)胞核。倒置顯微鏡下在每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)選取100個(gè)Hela細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-21的Hela細(xì)胞組黏附細(xì)菌數(shù)量要比陰性對(duì)照黏附細(xì)菌數(shù)量顯著減少（P＜0.05)，進(jìn)一步證實(shí)miR-21能抑制ETEC黏附Hela細(xì)胞。
　　 3.將重組miR-21真核表達(dá)載

5、體和陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，ETEC與轉(zhuǎn)染miR-21的Hela細(xì)胞相互作用不同時(shí)間后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-21的Hela細(xì)胞與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的Hela細(xì)胞相比，60min后CCL-20、TGFBI、ITBG8 mRNA表達(dá)水平分別下調(diào)1.74倍、2.11倍、3.47倍；90min后分別下調(diào)1.92倍、2.35倍、2.36倍；120min后分別下調(diào)2.33倍、3.01倍、2.49倍；150min后分別下