酪氨酸磷酸化蛋白和胞質(zhì)動(dòng)力蛋白在對(duì)蝦白斑癥病毒(WSSV)感染過程中的作用研究.pdf

1、為研究蛋白酪氨酸磷酸化在WSSV感染過程中所發(fā)揮的作用,本論文綜合運(yùn)用磷酸化特異性流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦顯微技術(shù)和蛋白免疫印跡法(western blotting)檢測(cè)了WSSV感染后中國對(duì)蝦血細(xì)胞中蛋白酪氨酸磷酸化水平的變化,并通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜( Matrix-assisted laser desorption/ionization tandem mass spectrometry:MALDI-TOF-MS/M

2、S)鑒定了血細(xì)胞內(nèi)在WSSV感染過程中發(fā)生酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)。以期為WSSV和宿主細(xì)胞相互作用過程的研究提供理論基礎(chǔ)。
　　研究表明,胞質(zhì)動(dòng)力蛋白在很多病毒的感染過程中發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)病毒的功能。為研究其在 WSSV感染過程中的作用,本論文首次克隆得到了胞質(zhì)動(dòng)力蛋白中間鏈基因,綜合運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)、激光共聚焦顯微技術(shù)和RNA干擾技術(shù)研究了胞質(zhì)動(dòng)力蛋白在 WSSV感染過程中基因表達(dá)量的變化及其在WSSV轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用。本研

3、究為探索WSSV在宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程提供了研究線索和理論基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)部分:
　　(1)利用磷酸化特異性流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了WSSV感染后中國對(duì)蝦血細(xì)胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化水平的變化。結(jié)果顯示,WSSV感染后,中國對(duì)蝦血細(xì)胞分為兩群:R2和R3,其中R2群血細(xì)胞表現(xiàn)出蛋白酪氨酸磷酸化水平的下降,而R3群血細(xì)胞則表現(xiàn)出蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高。隨著 WSSV感染進(jìn)程的持續(xù),總體血細(xì)胞的平均蛋白酪氨酸磷酸化水平表現(xiàn)出顯著

4、的動(dòng)態(tài)變化并呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì),分別在WSSV感染后1和12 h出現(xiàn)兩個(gè)峰值。
　　(2)通過激光共聚焦顯微鏡觀察到的WSSV感染后中國對(duì)蝦血細(xì)胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化信號(hào)強(qiáng)度變化和western blotting檢測(cè)到的中國對(duì)蝦血細(xì)胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化蛋白條帶粗細(xì)的變化與流式檢測(cè)的中國對(duì)蝦血細(xì)胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化水平的變化趨勢(shì)基本一致。激光共聚焦顯微觀察結(jié)果顯示酪氨酸磷酸化蛋白既存在于血細(xì)胞質(zhì)中也存在于細(xì)胞核中,但是WSSV感染后細(xì)胞核

5、中酪氨酸磷酸化水平的變化較細(xì)胞質(zhì)顯著。Western blotting共檢測(cè)到五個(gè)酪氨酸磷酸化蛋白,經(jīng)質(zhì)譜鑒定為α2-巨球蛋白(Alpha-2-macroglobulin:A2M)、熱應(yīng)激蛋白70(Heat shock protein70:HSP70)、組蛋白H3(Histone H3)、組蛋白H2A(Histone H2A)和組蛋白H4(Histone H4),其中HSP70、組蛋白H3和組蛋白H4只在WSSV感染后才發(fā)生酪氨酸磷酸化

6、;利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)了中國對(duì)蝦血細(xì)胞內(nèi)組蛋白H2A、H3和H4基因表達(dá)量在WSSV感染后的變化,三者在病毒感染后均顯著性上調(diào)表達(dá)。
　　(3)首次利用RACE技術(shù)從甲殼綱動(dòng)物—中國對(duì)蝦血細(xì)胞克隆得到了胞質(zhì)動(dòng)力蛋白中間鏈(FcDYNCI)基因全序列,為研究胞質(zhì)動(dòng)力蛋白在WSSV轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。結(jié)果顯示,FcDYNCI cDNA序列全長(zhǎng)2582 bp,含有一個(gè)1983 bp的開放閱讀框,該開放閱讀框可以編碼一個(gè)含有6

7、60個(gè)氨基酸的多肽,其理論分子量和理論等電點(diǎn)分別為73.4 kDa和5.16。通過與昆蟲綱的四種DYNCI蛋白的多序列比對(duì)分析,結(jié)果表明FcDYNCI屬于胞質(zhì)動(dòng)力蛋白Ⅱ型中間鏈蛋白。
　　(4)利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)了FcDYNCI基因在健康中國對(duì)蝦體內(nèi)各組織中的表達(dá)差異,結(jié)果顯示,FcDYNCI基因在血細(xì)胞中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他組織;WSSV感染后,中國對(duì)蝦血細(xì)胞內(nèi)FcDYNCI基因表現(xiàn)出顯著性上調(diào)表達(dá),約為未感染W(wǎng)SSV中國對(duì)

8、蝦血細(xì)胞內(nèi)FcDYNCI基因表達(dá)量的3倍;WSSV感染12 h后,對(duì)蝦血細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)動(dòng)力蛋白能夠與WSSV共定位。
　　(5)利用 RNAi技術(shù)對(duì)中國對(duì)蝦體內(nèi) FcDYNCI基因進(jìn)行了沉默,經(jīng)過兩次FcDYNCI dsRNA注射后,血細(xì)胞內(nèi)FcDYNCI基因表達(dá)量和蛋白量都出現(xiàn)顯著性下調(diào);在沉默F(xiàn)cDYNCI基因后,血細(xì)胞內(nèi)WSSV三種基因ie1、wsv477和vp28在24 h均表現(xiàn)出最大程度的下調(diào)表達(dá),分別約為對(duì)照組的1/27