中國對蝦白斑癥病毒(WSSV)血細胞受體蛋白的研究.pdf

1、白斑癥病毒(WSSV)病是危害我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要疾病之一，目前仍無切實有效的防控措施。病毒細胞受體是介導(dǎo)病毒的侵入門戶，因此WSSV細胞受體的尋找及鑒定是弄清病毒感染機理的關(guān)鍵點之一，也是實現(xiàn)白斑病防控的重要理論基礎(chǔ)。目前研究表明WSSV的多個囊膜蛋白含有RGD(Arg-Gly-AsP)模體，且其中多個囊膜蛋白的抗體被證實具有病毒中和活性，說明其與WSSV感染密切相關(guān)，由于細胞膜受體蛋白整合素能保守地與RGD模體結(jié)合，所以其可

2、能為WSSV潛在受體蛋白。本論文克隆了中國對蝦血細胞β-integrin基因cDNA全序列，序列特性分析顯示其含有整合素β亞基所有的經(jīng)典結(jié)構(gòu)域。RT-PCR分析該基因在不同組織內(nèi)和WSSV感染后的差異表達情況，顯示其與WSSV感染密切相關(guān)。在序列分析的基礎(chǔ)上對其進行分段表達，分別構(gòu)建β-integrin胞外區(qū)和VWA結(jié)構(gòu)域重組表達載體，特性研究顯示β-integrin重組蛋白具有的WSSV體外結(jié)合活性和體內(nèi)中和活性，證實了β-integ

3、rin為WSSV一個重要的細胞膜受體蛋白。制備了抗β-integrin單克隆抗體，利用其分析β-integrin的組織分布特性，結(jié)果顯示在WSSV易感組織器官內(nèi)β-integrin蛋白豐度顯著高于其他組織，揭示W(wǎng)SSV組織親嗜性的分子基礎(chǔ)；同時，大量制備抗中國對蝦血細胞膜單克隆抗體，建立受體單抗體外篩選模型，篩選到兩株具明顯阻斷效果的受體單抗，并對相應(yīng)的受體蛋白進行鑒定和功能驗證，結(jié)果顯示中國對蝦血藍蛋白和血細胞beta-actin能與

4、WSSV發(fā)生結(jié)合，這種結(jié)合可以被篩選到的單抗3C4和2F9所抑制，說明建立的WSSV受體單抗篩選體系可以應(yīng)用于WSSV受體研究。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 (1)設(shè)計簡并引物擴增中國對蝦血細胞整合素β亞基編碼基因的中間保守序列，通過RACE技術(shù)獲得整合素β亞基cDNA序列，序列全長2853 bp，含一個2349 bp的開放閱讀框，編碼783氨基酸。同源比對分析顯示該基因與整合素β1型亞基相似性最高。同時，利用半定量RT-PC

5、R分析了β-integrin基因在中國對蝦不同組織內(nèi)及其WSSV感染后鰓組織中的轉(zhuǎn)錄差異情況，結(jié)果顯示該基因在血細胞中轉(zhuǎn)錄水平最高，心臟和鰓組織次之，在腸道和性腺中也有較高的轉(zhuǎn)錄水平，在肌肉和肝胰腺中轉(zhuǎn)錄水平最低。中國對蝦在感染W(wǎng)SSV后，鰓組織中β-integrin基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，在感染后24小時到達最高水平，然后呈下降趨勢。從結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)該基因轉(zhuǎn)錄較高的組織為WSSV感染的主要靶器官，且在WSSV感染后出現(xiàn)明顯上調(diào)，說明該基

6、因與WSSV感染密切相關(guān)。
　　 (2)構(gòu)建了β-integrin胞外區(qū)和VWA結(jié)構(gòu)域融合表達載體pET32a-ER-βintegrin和pET32a-VWA-βintegrin，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后成功表達，分別獲得分子量大小為100和50 kDa的重組蛋白。ELISA和dot blotting實驗結(jié)果顯示，β-integrin胞外區(qū)和VWA結(jié)構(gòu)域重組表達蛋白均具有WSSV結(jié)合活性。通過螯蝦體內(nèi)中和實驗發(fā)現(xiàn)，β-integrin胞外

7、區(qū)重組表達蛋白具有顯著的WSSV中和活性，以上結(jié)果說明中國對蝦血細胞β-integrin為WSSV一個重要的細胞膜受體蛋白，在WSSV感染過程中發(fā)揮重要作用。
　　 (3)研制出5株特異性穩(wěn)定分泌抗中國對蝦血細胞β-integrin的雜交瘤細胞2C5、2C10、1F4、1C10和1D10。間接免疫熒光結(jié)果顯示5株單抗均可與中國對蝦血細胞膜結(jié)合，western blotting結(jié)果顯示，5株單抗均可以與β-integrinVWA結(jié)

8、構(gòu)域重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，同時能特異性識別1條分子量為120 kDa左右中國對蝦血細胞蛋白，推測其為中國對蝦血細胞β-integrin。以研制的抗中國對蝦血細胞β-integrin單克隆抗體，檢測β-integrin在不同組織器官內(nèi)的分布特性，在心臟、鰓和腸道中可以觀察到明顯的綠色熒光信號，而在肌肉和肝胰腺組織中則沒有觀察到明顯的熒光陽性信號，說明WSSV細胞膜受體蛋白β-integrin在病毒易感組織心臟、鰓和腸道中的豐度顯著高于肌

9、肉和肝胰腺組織，這一結(jié)果為揭示W(wǎng)SSV組織親嗜性的分子基礎(chǔ)提供了重要支持。
　　 (4)大量制備抗中國對蝦血細胞單克隆抗體，基于ELISA和dot blotting技術(shù)，以中國對蝦血細胞膜和地高辛標記的WSSV(WSSV-DIG)建立病毒受體單抗體外篩選模型，從制備的中國對蝦血細胞膜單克隆抗體中篩選到具有阻斷效果的單抗3C4和2F9。Western blotting結(jié)果顯示，篩選到的單抗3C4與中國對蝦血細胞1條分子量為42 k