對蝦白斑癥病毒(WSSV)囊膜蛋白VP31、VP110在中國明對蝦血細胞和鰓細胞中結合蛋白的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是引起養(yǎng)殖對蝦大規(guī)模死亡的主要病毒之一,目前仍然沒有有效的治療方法。學術界普遍認為,在病毒感染動物機體的過程中,病毒的表面蛋白(粘附蛋白)與宿主細胞上的某些功能蛋白結合后,引起動物發(fā)病。因此篩選、鑒定細胞受體是研究病毒感染機理的熱點之一,也是研究病毒病防治的重要理論基礎。目前研究表明WSSV的囊膜蛋白VP31的多克隆抗體能部分阻斷WSSV侵染對蝦且延緩了感染蝦

2、的死亡;RGDT合成多肽能抑制WSSV囊膜蛋白VP110和宿主細胞的結合,這些實驗證明VP31和VP110在WSSV侵染宿主過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究對WSSV囊膜蛋白VP31和VP110進行了原核表達,以重組VP31(rVP31)為探針利用病毒鋪覆蛋白印跡技術(virus overlay binding-protein assay, VOPBA)鑒定到中國明對蝦血細胞上的一條26kDa大小的蛋白和rVP31之間有相互作用,經蛋白質

3、譜(mass spectrometry, MS)鑒定后,得到磷酸丙糖異構酶(triosephosphate isomerase,TPI)為rVP31在中國明對蝦血細胞上的結合蛋白;利用Pull-down和VOPBA技術檢測rVP110在中國明對蝦鰓細胞上的結合蛋白分別為精氨酸激酶(Arginine kinase, AK)和肌動蛋白(β-actin),在血細胞上的結合蛋白為β-actin。具體研究內容和結果如下:
 ?。?)WSSV

4、-VP31結合蛋白的鑒定。將WSSV囊膜蛋白VP31的基因用一對特異性引物通過PCR擴增得到VP31的基因,將其與表達質粒pGEX-4T-1連接后,轉化BL21(DE3)表達菌,將經菌落PCR和測序鑒定正確的重組表達菌的單克隆菌落進行原核表達。表達純化后的重組蛋白rVP31作為蛋白探針,利用VOPBA技術發(fā)現(xiàn)與中國明對蝦血細胞中一條蛋白帶出現(xiàn)反應,經蛋白質譜MS鑒定26kDa蛋白條帶與BosTaurus磷酸丙糖異構酶(TPI)相似。為了

5、驗證TPI與WSSV-VP31之間的結合作用和TPI在WSSV侵染宿主過程中的作用,我們克隆了中國明對蝦的TPI基因將其進行原核表達得到TPI重組蛋白(rTPI),運用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和Pull-down試驗驗證了rVP31和rTPI之間的相互作用。并且在動物中和實驗中得知rTPI在WSSV侵染蝦的過程中有一定的阻滯做作用。利用real-time quantity RT-PCR檢測中國明對蝦不同組織中及感染WSSV后不同時

6、間點血細胞中TPI的mRNA轉錄水平,結果表明在性腺中TPI的轉錄水平最高,腸道中轉錄水平最底;WSSV感染后表達量呈現(xiàn)下降趨勢。
 ?。?)WSSV-VP110結合蛋白的鑒定。將WSSV-VP110具有蛋白結合功能的FHA模塊蛋白大小為546bp基因片段擴增后與表達質粒pET-32(a)+構建了重組質粒pET-32-VP110,轉化表達菌BL21(DE3),將重組表達菌進行原核表達,表達純化VP110的重組蛋白(rVP110)。

7、利用Pull-down和VOPBA的方法篩選到中國明對蝦鰓細胞中有兩條特異性蛋白條帶和rVP110可以特異性結合,經MS鑒定分別為肌動蛋白(β-actin)和精氨酸激酶(Arginine Kinase,AK)。Pull-down和VOPBA方法鑒定中國明對蝦血細胞中的β-actin為VP110的結合蛋白。β-actin已證明在WSSV侵染宿主過程中起著一定的作用,為驗證 AK和WSSV-VP110之間的相互作用,將AK基因的PCR產物與

8、表達質粒載體pGEX-4T-1連接構建重組質粒pGEX-AK,原核表達得到了重組精氨酸激酶蛋白(rAK),然后用Pull-down和ELISA實驗鑒定了精氨酸激酶和rVP110之間的相互作用。在動物中和實驗中驗證了精氨酸激酶在WSSV侵染宿主過程中可以減少克氏螯蝦的死亡率。檢測中國明對蝦感染WSSV前后鰓細胞中AK酶活的變化;利用real-time quantity PCR檢測中國明對蝦不同組織中和感染WSSV后不同時間點鰓細胞中AK的

9、基因轉錄水平,表明AK在肌肉組織中轉錄水平最高,腸道中水平最低;感染WSSV后18h的基因轉錄水平達到最高峰值,然后表達量下降36-48h時表達量最低,72h后恢復到感染前水平。
  本論文主要對WSSV的此兩種囊膜蛋白VP31和VP110進行了在中國明對蝦上結合蛋白方面的研究探索,實驗結果表明WSSV-VP31和WSSV-VP110在中國明對蝦的血細胞和鰓細胞蛋白中有結合蛋白,其結合蛋白且在動物中和試驗中表現(xiàn)出中和活性,由此進一

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