對(duì)蝦白斑癥病毒(WSSV)囊膜蛋白VP31、VP110在中國(guó)明對(duì)蝦血細(xì)胞和鰓細(xì)胞中結(jié)合蛋白的研究.pdf

1、白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是引起養(yǎng)殖對(duì)蝦大規(guī)模死亡的主要病毒之一,目前仍然沒(méi)有有效的治療方法。學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為，在病毒感染動(dòng)物機(jī)體的過(guò)程中，病毒的表面蛋白（粘附蛋白）與宿主細(xì)胞上的某些功能蛋白結(jié)合后，引起動(dòng)物發(fā)病。因此篩選、鑒定細(xì)胞受體是研究病毒感染機(jī)理的熱點(diǎn)之一，也是研究病毒病防治的重要理論基礎(chǔ)。目前研究表明WSSV的囊膜蛋白VP31的多克隆抗體能部分阻斷WSSV侵染對(duì)蝦且延緩了感染蝦

2、的死亡；RGDT合成多肽能抑制WSSV囊膜蛋白VP110和宿主細(xì)胞的結(jié)合，這些實(shí)驗(yàn)證明VP31和VP110在WSSV侵染宿主過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本研究對(duì)WSSV囊膜蛋白VP31和VP110進(jìn)行了原核表達(dá)，以重組VP31（rVP31）為探針利用病毒鋪覆蛋白印跡技術(shù)（virus overlay binding-protein assay, VOPBA）鑒定到中國(guó)明對(duì)蝦血細(xì)胞上的一條26kDa大小的蛋白和rVP31之間有相互作用，經(jīng)蛋白質(zhì)

3、譜（mass spectrometry, MS）鑒定后，得到磷酸丙糖異構(gòu)酶（triosephosphate isomerase，TPI）為rVP31在中國(guó)明對(duì)蝦血細(xì)胞上的結(jié)合蛋白；利用Pull-down和VOPBA技術(shù)檢測(cè)rVP110在中國(guó)明對(duì)蝦鰓細(xì)胞上的結(jié)合蛋白分別為精氨酸激酶(Arginine kinase, AK)和肌動(dòng)蛋白（β-actin），在血細(xì)胞上的結(jié)合蛋白為β-actin。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　?。?）WSSV

4、-VP31結(jié)合蛋白的鑒定。將WSSV囊膜蛋白VP31的基因用一對(duì)特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增得到VP31的基因，將其與表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1連接后，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）表達(dá)菌，將經(jīng)菌落PCR和測(cè)序鑒定正確的重組表達(dá)菌的單克隆菌落進(jìn)行原核表達(dá)。表達(dá)純化后的重組蛋白rVP31作為蛋白探針，利用VOPBA技術(shù)發(fā)現(xiàn)與中國(guó)明對(duì)蝦血細(xì)胞中一條蛋白帶出現(xiàn)反應(yīng)，經(jīng)蛋白質(zhì)譜MS鑒定26kDa蛋白條帶與BosTaurus磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）相似。為了

5、驗(yàn)證TPI與WSSV-VP31之間的結(jié)合作用和TPI在WSSV侵染宿主過(guò)程中的作用，我們克隆了中國(guó)明對(duì)蝦的TPI基因?qū)⑵溥M(jìn)行原核表達(dá)得到TPI重組蛋白（rTPI），運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）和Pull-down試驗(yàn)驗(yàn)證了rVP31和rTPI之間的相互作用。并且在動(dòng)物中和實(shí)驗(yàn)中得知rTPI在WSSV侵染蝦的過(guò)程中有一定的阻滯做作用。利用real-time quantity RT-PCR檢測(cè)中國(guó)明對(duì)蝦不同組織中及感染W(wǎng)SSV后不同時(shí)

6、間點(diǎn)血細(xì)胞中TPI的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明在性腺中TPI的轉(zhuǎn)錄水平最高，腸道中轉(zhuǎn)錄水平最底；WSSV感染后表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。
　?。?）WSSV-VP110結(jié)合蛋白的鑒定。將WSSV-VP110具有蛋白結(jié)合功能的FHA模塊蛋白大小為546bp基因片段擴(kuò)增后與表達(dá)質(zhì)粒pET-32(a)+構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-32-VP110，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21（DE3）,將重組表達(dá)菌進(jìn)行原核表達(dá)，表達(dá)純化VP110的重組蛋白（rVP110）。

7、利用Pull-down和VOPBA的方法篩選到中國(guó)明對(duì)蝦鰓細(xì)胞中有兩條特異性蛋白條帶和rVP110可以特異性結(jié)合，經(jīng)MS鑒定分別為肌動(dòng)蛋白（β-actin）和精氨酸激酶（Arginine Kinase，AK）。Pull-down和VOPBA方法鑒定中國(guó)明對(duì)蝦血細(xì)胞中的β-actin為VP110的結(jié)合蛋白。β-actin已證明在WSSV侵染宿主過(guò)程中起著一定的作用，為驗(yàn)證 AK和WSSV-VP110之間的相互作用，將AK基因的PCR產(chǎn)物與

8、表達(dá)質(zhì)粒載體pGEX-4T-1連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-AK，原核表達(dá)得到了重組精氨酸激酶蛋白（rAK），然后用Pull-down和ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定了精氨酸激酶和rVP110之間的相互作用。在動(dòng)物中和實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了精氨酸激酶在WSSV侵染宿主過(guò)程中可以減少克氏螯蝦的死亡率。檢測(cè)中國(guó)明對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV前后鰓細(xì)胞中AK酶活的變化；利用real-time quantity PCR檢測(cè)中國(guó)明對(duì)蝦不同組織中和感染W(wǎng)SSV后不同時(shí)間點(diǎn)鰓細(xì)胞中AK的

9、基因轉(zhuǎn)錄水平，表明AK在肌肉組織中轉(zhuǎn)錄水平最高，腸道中水平最低；感染W(wǎng)SSV后18h的基因轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高峰值，然后表達(dá)量下降36-48h時(shí)表達(dá)量最低,72h后恢復(fù)到感染前水平。
　　本論文主要對(duì)WSSV的此兩種囊膜蛋白VP31和VP110進(jìn)行了在中國(guó)明對(duì)蝦上結(jié)合蛋白方面的研究探索，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明WSSV-VP31和WSSV-VP110在中國(guó)明對(duì)蝦的血細(xì)胞和鰓細(xì)胞蛋白中有結(jié)合蛋白，其結(jié)合蛋白且在動(dòng)物中和試驗(yàn)中表現(xiàn)出中和活性，由此進(jìn)一