2型登革病毒特異性單克隆抗體保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、登革病毒(Dengue Virus，DENV)是黃病毒屬、有包膜的單股正鏈RNA病毒，由于包膜蛋白的抗原性不同，又分為四種血清型，即DENV1～4。DENV主要以埃及伊蚊和白紋伊蚊為媒介而廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)。每年，DENV會(huì)導(dǎo)致數(shù)百萬(wàn)人感染，引起登革熱(dengue classical fever，DF)和登革出血熱/休克綜合癥(denguehemorrhagic fever/dengue shock syndrome，DHF/

2、DSS)。DF是自限性發(fā)熱性疾病：而DHF/DSS則是威脅患者生命的重癥，其主要特征是血管通透性顯著增加，導(dǎo)致血漿滲漏。每年有大約50萬(wàn)DHF/DSS患者需要及時(shí)入院治療，否則病死率高達(dá)50％。然而，DHF/DSS的發(fā)病機(jī)制，以及DENV與宿主細(xì)胞之間相互作用的機(jī)制尚不清楚。 雖然在過(guò)去幾十年中，研究者從多方式、多角度入手研制DENV的疫苗，但至今仍沒(méi)有預(yù)防和治療DENV感染的疫苗和藥物。無(wú)論是減毒活疫苗、多價(jià)疫苗，還是核酸疫苗

3、、蛋白成分疫苗都遇到DENV流行株抗原變異、抗體增強(qiáng)效應(yīng)(antibodydependent enhancement，ADE)等障礙而進(jìn)展緩慢。 基于近年來(lái)DHF/DSS患者數(shù)量明顯增加和上述研究現(xiàn)狀，被動(dòng)免疫或者說(shuō)是治療性單克隆抗體(Monoclonal antibodies，mAb)再次引起了研究者的關(guān)注。早在1907年人體抗血清就被用來(lái)治療麻疹病毒感染的患者。20世紀(jì)40年代起，從高免疫的血清中提取的免疫球蛋白來(lái)預(yù)防和治療

4、病毒感染成為熱點(diǎn)，部分制品至今還被用于臨床治療。而特異性不高、成分復(fù)雜和潛在的疾病傳播途徑等缺陷極大的限制了此類生物制劑的使用。1982年mAb技術(shù)的出現(xiàn)后，研發(fā)高中和特性的mAb用于預(yù)防和治療病毒性疾病就受到研究者的青睞。特別是進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，生物技術(shù)和工業(yè)技術(shù)的進(jìn)步，大量的治療性mAb藥物已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)或已應(yīng)用于臨床，成為生物制藥中增長(zhǎng)最快的部分。治療性mAb成為防治病毒的新手段，新焦點(diǎn)。 因此，無(wú)論從研究DENV病理機(jī)制

5、角度，還是從研發(fā)治療性mAb角度，獲得多株特異性mAb具有重要意義。特別是具有高中和能力的mAb，是研究致病機(jī)制的免疫學(xué)工具和治療性mAb的基本材料。本試驗(yàn)首先通過(guò)蔗糖密度梯度高速離心獲得純化的DENV2(Tr1751)株的具感染活性的病毒顆粒，并利用純化的病毒顆粒免疫SPF級(jí)BALB/c小鼠。之后通過(guò)雜交瘤細(xì)胞技術(shù)獲得分泌DENV特異性mAb的雜交瘤細(xì)胞株10株，78＃、1E7、2B10、6C1、6H3、7F7、886、8F12、8H

6、1、8H4。然后分別對(duì)10株mAb進(jìn)行性質(zhì)鑒定，其中具有中和能力的mAb有7株(2810、78＃、1E7、7F7、886、8F12、8H4)包括2株中和能力較高的mAbs(78＃、8F12)，并對(duì)其在體內(nèi)外的保護(hù)活性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果提示通過(guò)全病毒免疫來(lái)制備中和抗體具有一定的優(yōu)勢(shì)，獲得的mAbs也為后續(xù)研究DENV的致病機(jī)理，以及治療性mAb的研發(fā)提供了有利的免疫學(xué)工具。 本研究主要結(jié)果與結(jié)論如下： 1.建立了純化的DENV

7、2的方法，獲得具有感染性的純化病毒 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)DENV2的天然中介宿主細(xì)胞白紋伊蚊C6/36細(xì)胞增殖出大量病毒，并測(cè)定病毒滴度。除去細(xì)胞碎片后，使用PEG-8000對(duì)病毒進(jìn)行濃縮，測(cè)定濃度病毒滴度。最后通過(guò)蔗糖密度梯度高速離心來(lái)獲得純化的DENV2具感染性的病毒顆粒，并通過(guò)病毒滴度測(cè)定和SDS-PAGE來(lái)驗(yàn)證純化病毒及其含量。通過(guò)不同蔗糖密度梯度比較，確定了DENV2主要沉降區(qū)帶，建立了純化DENV的方法，并制備了一定量的純化病

8、毒供下述實(shí)驗(yàn)使用。 2.通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得10株鼠源性抗DENV2的mAbs 利用純化的DENV2病毒顆粒免疫SPF級(jí)的BALB/c小鼠10只，細(xì)胞融合前取小鼠尾血進(jìn)行細(xì)胞爬片間接免疫熒光染色，檢測(cè)特異性抗體產(chǎn)生情況。無(wú)菌條件下取出免疫效果好的小鼠脾臟，機(jī)械分離為單個(gè)細(xì)胞后與小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0在融合劑PEG-4000的作用下形成雜交瘤細(xì)胞。通過(guò)HAT培養(yǎng)篩選、間接ELISA陽(yáng)性篩選和反復(fù)單克隆化等方法，獲得了10

9、株分泌DENV2特異性mAbs的穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞株，命名為78＃、1E7、2810、6C1、6H3、7F7、886、8F12、8H1、8H4。以無(wú)血清1640培養(yǎng)液分別培養(yǎng)各雜交瘤細(xì)胞來(lái)獲得濃度較低的mAb或通過(guò)小鼠腹腔注射培養(yǎng)來(lái)獲得大量較高濃度的mAb腹水，供下述實(shí)驗(yàn)使用。 3.10株mAbs性質(zhì)的鑒定 4.PRNT測(cè)定10株mAbs的中和活性 以非洲綠猴Vero細(xì)胞為測(cè)試細(xì)胞，mAb-DENV2混合物為感染源，

10、正常鼠血清(normal mouse sera，NMS)-DENV2混合物為陰性對(duì)照，測(cè)定50％病毒中和濃度-PRNT50。 待Vero細(xì)胞在24孔板中單層覆蓋生長(zhǎng)后，將mAb(或NMS)倍比稀釋1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320。加入等體積的病毒稀釋液后，mAb(或NMS)的實(shí)際稀釋度為1:20、1:40、1:80、1：160、1:320、1:640?？刂萍尤氲牟《玖?，1 ml混合物中含有約1000

11、 PFU的DENV2。mAb-DENV2(或NMS- DENV2)混合物37℃水浴1h后，每孔200μl加入各孔中37℃孵育1.5 h。每孔約含有200 PFU的病毒和不同稀釋度的抗體(或NMS)。之后以含1,2％的甲基纖維素的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，再通過(guò)結(jié)晶紫染色對(duì)病毒形成的噬斑(Plaque)進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過(guò)比對(duì)相同稀釋度NMS的陰性孔，觀察各株mAb有無(wú)中和作用，并計(jì)算中和抗體的PRNTso值。具有中和能力的mAb有7株：78＃(1

12、:60)、1E7(1:30)、2810(1:35)、7F7(1:20)、886(1:30)、8F12(1:40)、8H4(1:15)。其中具有較高中和能力的2株mAbs:78＃和8F12，兩者混合后的PRNTso達(dá)到1:80。 5. BALB/c乳鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn) 以BALB/c新生乳鼠(生后第2天)為DENV2挑戰(zhàn)及抗體體內(nèi)保護(hù)的研究對(duì)象，以體外實(shí)驗(yàn)中具有較高中和能力的78＃和8F12 mAbs為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，NMS為陰性對(duì)照。

13、將mAb-DENV2或NMS-DENV2混合物37℃水浴1 h后，通過(guò)乳鼠腦內(nèi)注射，進(jìn)行病毒挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)。在對(duì)高低兩個(gè)病毒進(jìn)入量104 PFU和500 PFU進(jìn)行比較的同時(shí)，分別對(duì)兩株mAbs的體內(nèi)保護(hù)性進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)它們均在一定程度上起到保護(hù)作用，乳鼠發(fā)病和死亡時(shí)間均比對(duì)照組延后。特別是在病毒進(jìn)入量較低時(shí)，保護(hù)作用更為明顯。在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將兩株mAbs進(jìn)行“cocktail”組合實(shí)驗(yàn)。取500 PFU的病毒進(jìn)入量，mAbs-DENV

14、2于37℃水浴1h后注射。結(jié)果顯示抗體的保護(hù)作用大幅度提高。乳鼠發(fā)病和死亡時(shí)間比對(duì)照組延后更顯著，并且有16.7％的乳鼠被徹底保護(hù)(存活超過(guò)2周的觀察期)。 總之，本實(shí)驗(yàn)建立了通過(guò)蔗糖密度梯度高速離心來(lái)純化DENV2的方法，并以純化病毒為抗原免疫BALB/c小鼠。通過(guò)免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合、篩選，獲得了10株DENV2特異性的mAbs。經(jīng)過(guò)性質(zhì)鑒定，我們對(duì)10株mAbs所識(shí)別的病毒蛋白、抗體飽和度、免疫學(xué)活性等多方面